f*********8 发帖数: 129 | 1 用pipette tip? 需要加trypsin吗?
多谢 |
h*****n 发帖数: 2023 | |
f*********8 发帖数: 129 | 3 谢谢,再问一下
有哪里需要加trypsin,还是直接用tip刮下来,放到dish里?这样长会均匀吗?
【在 h*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : pipette tip
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b**********8 发帖数: 349 | 4 我最近也在做稳转,向实验室别人学的方法,待single colony形成至肉眼清晰可辨,
但是还没有互相融合之前,洗去medium,PBS漂洗一次,在dish背面用marker笔标记每
一个colony的位置,加TE润洗一次,(10ml dish加1ml TE,让TE在短时间内分布均匀
,立即吸去),等待1min后用白色的tips吸取10ul的新鲜medium(含选择抗生素)在每
一个colony上面来回轻轻吹打3~4次,然后全部转移到24孔板中,如此重复,效果挺好
。 |
f*********8 发帖数: 129 | 5 多谢。
【在 b**********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近也在做稳转,向实验室别人学的方法,待single colony形成至肉眼清晰可辨, : 但是还没有互相融合之前,洗去medium,PBS漂洗一次,在dish背面用marker笔标记每 : 一个colony的位置,加TE润洗一次,(10ml dish加1ml TE,让TE在短时间内分布均匀 : ,立即吸去),等待1min后用白色的tips吸取10ul的新鲜medium(含选择抗生素)在每 : 一个colony上面来回轻轻吹打3~4次,然后全部转移到24孔板中,如此重复,效果挺好 : 。
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c****g 发帖数: 93 | 6 这个说的比较全面了,再补充一点:我是直接弃medium,加上3~4ml的pbs别让它干掉
,然后用10ul的tips吸取10ul 胰酶用你说的方法即可;还有一点,弄个镜子在下面反
光透过dish,或者弄个台灯让光从下面投上来,克隆清晰可见。这个方法大好。
【在 b**********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近也在做稳转,向实验室别人学的方法,待single colony形成至肉眼清晰可辨, : 但是还没有互相融合之前,洗去medium,PBS漂洗一次,在dish背面用marker笔标记每 : 一个colony的位置,加TE润洗一次,(10ml dish加1ml TE,让TE在短时间内分布均匀 : ,立即吸去),等待1min后用白色的tips吸取10ul的新鲜medium(含选择抗生素)在每 : 一个colony上面来回轻轻吹打3~4次,然后全部转移到24孔板中,如此重复,效果挺好 : 。
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f*********8 发帖数: 129 | 7 谢谢。再问问:
single conoly一般多久可以在显微镜下看到?会不会到最后什么都没有,没有就重新
转吗?如果有,Positive的也不多?
【在 c****g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个说的比较全面了,再补充一点:我是直接弃medium,加上3~4ml的pbs别让它干掉 : ,然后用10ul的tips吸取10ul 胰酶用你说的方法即可;还有一点,弄个镜子在下面反 : 光透过dish,或者弄个台灯让光从下面投上来,克隆清晰可见。这个方法大好。
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c****g 发帖数: 93 | 8 我做的是CHO cells, >10个细胞的一个克隆用我的方法基本能看到。一般的细胞及时
体积小点也应该是这个数量级吧。最后有没有clone还是依赖于你的效率,实在没有的
话就转染的plasmids多一些吧,我们一般10k cells/100mm dish,1-2ug plasmid,
48hr之后 add selection pressure。如果有clone,你后续的还要通过免疫组化或
western blot鉴定呢,通常positive的挺多的。
【在 f*********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢。再问问: : single conoly一般多久可以在显微镜下看到?会不会到最后什么都没有,没有就重新 : 转吗?如果有,Positive的也不多?
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f*********8 发帖数: 129 | 9 谢谢。
我做的是U2OS,刚transfect了一星期,还不知道怎样。如果有多一点的resistant
clones那还好。后面会用western鉴定。就怕最后一个都没有,又要重来。
【在 c****g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我做的是CHO cells, >10个细胞的一个克隆用我的方法基本能看到。一般的细胞及时 : 体积小点也应该是这个数量级吧。最后有没有clone还是依赖于你的效率,实在没有的 : 话就转染的plasmids多一些吧,我们一般10k cells/100mm dish,1-2ug plasmid, : 48hr之后 add selection pressure。如果有clone,你后续的还要通过免疫组化或 : western blot鉴定呢,通常positive的挺多的。
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