d****i
发帖数: 2346 | 1 不知道有什么窍门，内参和目的蛋白的total做得出，但是磷酸化做不出.sample用的是
阳性对照的drug刺激细胞后的lysate。
请做过的同学教几招。谢谢！ |
s*****o
发帖数: 26 | 2 只做过一次，好像要注意不能用PBS洗细胞。
Critical Steps
Do not wash cells with a phosphate-containing buffer such as PBS. Load all
lanes of each gel with only simultaneously prepared samples. Because
transfer of phosphorylated proteins from a gel with Mn2+-Phos-tag is
difficult, the gel should be first soaked in EDTA-containing transfer buffer
B and the original semi-dry transfer method4 using three transfer buffers
should be performed.
http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/594#/reagents
【在 d****i 的大作中提到】
: 不知道有什么窍门，内参和目的蛋白的total做得出，但是磷酸化做不出.sample用的是
: 阳性对照的drug刺激细胞后的lysate。
: 请做过的同学教几招。谢谢！
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d****i
发帖数: 2346 | 3 你的buffer用的是RIPA buffer吗？我用的是这个，里面有EDTA，不知道是不是buffer
的原因。但是又看到说EDTA不超过1mM就可以。
还有一定要用PVDF膜吗？老板说可能也有关系。 |
d****i
发帖数: 2346 | 4 你的buffer用的是RIPA buffer吗？我用的是这个，里面有EDTA，不知道是不是buffer
的原因。但是又看到说EDTA不超过1mM就可以。
还有一定要用PVDF膜吗？老板说可能也有关系。 |
s*****o
发帖数: 26 | 5 是的，好像ripa buffer里面不要有EDTA。pierce ripa buffer可以用，Cell
signaling的有EDTA。你也可以自己配。
buffer
【在 d****i 的大作中提到】
: 你的buffer用的是RIPA buffer吗？我用的是这个，里面有EDTA，不知道是不是buffer
: 的原因。但是又看到说EDTA不超过1mM就可以。
: 还有一定要用PVDF膜吗？老板说可能也有关系。
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d****i
发帖数: 2346 | |
