b**********8
发帖数: 349 | 1 最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pLP2
9.0 ug pVSVG.
Then add in this order:
293.3 ul of TE buffer (0.1×, pH 8.8)
155.6 ul d.d.water
50.2 ul CaCl2 (2.5M)
Briefly mix, then add 500 ul 2×HBSS, dropwise under agitation by vortexing
at least 1~2min.
Wait at least 5min(no more than 30min) at RT.
我看到别的常用的protocol，都是加齐各种质粒后直接用双蒸水补齐到500ul，然后再
加等体积的HBSS，最后加一定量的CaCl2。不知道我们这个protocol里加0.1×, pH 8.8
的TE用意何在？
2）在转染后36和60小时收集病毒上清，3000 × g for 15 minutes at 4℃ to remove
cells and cell debris. 然后用PEG-it Virus Precipitation Solution在4度沉淀至
少12小时，1500 × g for 30
minutes at 4ºC离心后用PBS重悬病毒颗粒，分装保存与-70度。每次用浓缩后的
病毒感染肝癌细胞后，都能在medium里面看到很多黑色的小点点（师姐包装的病毒也有
，但没这么明显），又不是污染，不同的细胞株里这个小黑点的多寡不一，有的很多很
多。很纳闷这个黑点到底来源于什么？磷酸钙沉淀？239FT细胞碎片？KD效率低是不是
因为这些小黑点的原因？
切盼高手指教，更期望分享各种成功的技巧和经验。
不甚感谢 |
g*********5
发帖数: 2533 | 2 为什么要钙转？效率低。
换mirus Transit LT1。
openbiosystem 有protocol |
b**********8
发帖数: 349 | 3 谢谢楼上，终于等到回复了
鉴于我帖子中描述的这个protocol已经是我师姐建立的很成熟的方法，不过在我这里遇
到了一些问题，所以我更期待针对这些问题的意见和建议，目前暂不考虑更换protocol
，谢谢啦 |
q******g
发帖数: 3858 | |
b**********8
发帖数: 349 | 5
是一样的，我们一直使用的sigma 的 PLKO.1-puro-shRNA 质粒，我现在每次都是从师
姐留给我的那管质粒中取一点出来做转化然后midiprep。
【在 q******g 的大作中提到】
: 你的shRNA和你师姐的完全一样吗？
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d*p
发帖数: 534 | 6 然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。
48-72小时候再看是否有GFP。GFP Debries, 会附在细胞上，看起来阳性，实际不是。 |
b**********8
发帖数: 349 | 7 好的，下次我再试试看
【在 d*p 的大作中提到】
: 然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
: 能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
: 有问题。
: 48-72小时候再看是否有GFP。GFP Debries, 会附在细胞上，看起来阳性，实际不是。
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