s******y
发帖数: 28562 | 1 厚着脸皮来问一下，需要做cloning在一个质粒里同时表达四个基因，
以前知道有些iPS 的质粒可以做这个事情，请问大家知不知道那个质粒
叫什么名字？ |
l******g
发帖数: 1623 | 2 一般plasmid都可以的吧, 放4个expression cassette就可以了. 作过3个CMV
cassette的, 有一个有IRES, 表达了4个gene
【在 s******y 的大作中提到】
: 厚着脸皮来问一下，需要做cloning在一个质粒里同时表达四个基因，
: 以前知道有些iPS 的质粒可以做这个事情，请问大家知不知道那个质粒
: 叫什么名字？
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s******y
发帖数: 28562 | 3 你的意思是说直接把CMV-poly-A 那一段都砍下来，然后把四段直接连到一起？
这么做真的可以么？我怎么总觉得怪怪的有什么地方不对的样子？
【在 l******g 的大作中提到】
: 一般plasmid都可以的吧, 放4个expression cassette就可以了. 作过3个CMV
: cassette的, 有一个有IRES, 表达了4个gene
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a****d
发帖数: 1919 | 4 People used 2A peptide to link four ORF in a row for co-expression.
http://www.pnas.org/content/106/1/157.full |
g*********5
发帖数: 2533 | 5 sunny, check the new 2a peptide
http://www.nature.com/gt/journal/v11/n23/full/3302361a.html
baozi, hehe
【在 s******y 的大作中提到】
: 厚着脸皮来问一下，需要做cloning在一个质粒里同时表达四个基因，
: 以前知道有些iPS 的质粒可以做这个事情，请问大家知不知道那个质粒
: 叫什么名字？
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g*********5
发帖数: 2533 | 6 sunny, check the new 2a peptide
http://www.nature.com/gt/journal/v11/n23/full/3302361a.html
baozi, hehe
【在 s******y 的大作中提到】
: 厚着脸皮来问一下，需要做cloning在一个质粒里同时表达四个基因，
: 以前知道有些iPS 的质粒可以做这个事情，请问大家知不知道那个质粒
: 叫什么名字？
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l******g
发帖数: 1623 | 7 很多公司都用这这consruct作抗体生产, 产量每升以克计
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的意思是说直接把CMV-poly-A 那一段都砍下来，然后把四段直接连到一起？
: 这么做真的可以么？我怎么总觉得怪怪的有什么地方不对的样子？
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g*********5
发帖数: 2533 | 8 忽见sunny来建楼
急忙来把问题狗
猛抬头，见4楼
一江包子顺水流 |
y******8
发帖数: 1764 | 9 大段的promoter相同序列，克隆，表达都会有重组，silencing问题。如果有特殊菌株或者细胞系，可以
一试。
如果用很短的序列，如TetO，问题不是很大。可以同时驱动基因很多表达。
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的意思是说直接把CMV-poly-A 那一段都砍下来，然后把四段直接连到一起？
: 这么做真的可以么？我怎么总觉得怪怪的有什么地方不对的样子？
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s******y
发帖数: 28562 | 10 我记得有一个标准的做法发在Nature Cell Biology的，但是我怎么都想不起
在哪篇文章里，谁有印象的来说一说？
【在 a****d 的大作中提到】
: People used 2A peptide to link four ORF in a row for co-expression.
: http://www.pnas.org/content/106/1/157.full
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s******y
发帖数: 28562 | 11 等问题解决之后肯定大家都有包子的：）
【在 g*********5 的大作中提到】
: 忽见sunny来建楼
: 急忙来把问题狗
: 猛抬头，见4楼
: 一江包子顺水流
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C*****h
发帖数: 926 | 12 用baculovirus vector，可以同时表达十二个genes
【在 s******y 的大作中提到】
: 厚着脸皮来问一下，需要做cloning在一个质粒里同时表达四个基因，
: 以前知道有些iPS 的质粒可以做这个事情，请问大家知不知道那个质粒
: 叫什么名字？
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s******y
发帖数: 28562 | 13 我倒，我其实就是要转一个普通的老鼠细胞用的。
其实。。。我就是不记得那个可以同时转四个蛋白的用来做iPS的质粒叫什么名字了。
。。
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用baculovirus vector，可以同时表达十二个genes
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i*****i
发帖数: 154 | 14 Nat Biotechnol. 2004 May;22(5):589-94. Epub 2004 Apr 4.
Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving'
2A peptide-based retroviral vector.
Szymczak AL, Workman CJ, Wang Y, Vignali KM, Dilioglou S, Vanin EF, Vignali
DA. |
D***y
发帖数: 693 | 15 addgene有个lentivirus based载体：FUW-SOKM ，是Rudolf Jaenisch实验室的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我倒，我其实就是要转一个普通的老鼠细胞用的。
: 其实。。。我就是不记得那个可以同时转四个蛋白的用来做iPS的质粒叫什么名字了。
: 。。
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i*****i
发帖数: 154 | 16 老大要找的质粒应该是叫STEMCCA
Stem Cells. 2009 Mar;27(3):543-9.
Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell
cassette.
Sommer CA, Stadtfeld M, Murphy GJ, Hochedlinger K, Kotton DN, Mostoslavsky G.
Abstract
Induced pluripotent stem (iPS) cells can be generated using retroviral
vectors expressing Oct4, Klf4, Sox2, and cMyc. Most prior studies have
required multiple retroviral vectors for reprogramming, resulting in high
numbers of genomic integrations in iPS cells and limiting their use for
therapeutic applications. Here we describe the use of a single lentiviral
vector expressing a "stem cell cassette" composed of the four transcription
factors and a combination of 2A peptide and internal ribosome entry site
technology, generating iPS cells from postnatal fibroblasts. iPS cells
generated in this manner display embryonic stem cell-like morphology,
express stem cell markers, and exhibit in vivo pluripotency, as evidenced by
their ability to differentiate in teratoma assays and their robust
contribution to mouse chimeras. Combining all factors into a single
transcript achieves the most efficient reprogramming system to date and
allows derivation of iPS cells with a single viral integration. The use of a
single lentiviral vector for reprogramming represents a powerful laboratory
tool and a significant step toward the application of iPS technology for
clinical purposes.
PMID: 19096035 |
D***y
发帖数: 693 | 17 这个载体就是
Rudolf Jaenisch
用来做ips cell
de 【 在 DBguy (DBguy) 的大作中提到: 】 |
D***y
发帖数: 693 | 18 check this out:
Reprogramming of murine and human somatic cells. Bryce W. Careya,b, Styliani
Markoulakia, Jacob Hannaa, Kris Sahaa, Qing Gaoa, Maisam Mitalipovaa,1,
and Rudolf Jaenischa,b, PNAS 2008
using a single polycistronic vector
【在 s******y 的大作中提到】
: 厚着脸皮来问一下，需要做cloning在一个质粒里同时表达四个基因，
: 以前知道有些iPS 的质粒可以做这个事情，请问大家知不知道那个质粒
: 叫什么名字？
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o**i
发帖数: 1165 | 19 co－ask 这个2A的技术是不是只能在mammalian cell里面用？ |
g*********5
发帖数: 2533 | 20 Just kiding, as you own me a baozi, hoho.
【在 s******y 的大作中提到】
: 等问题解决之后肯定大家都有包子的：）
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T**********t
发帖数: 1604 | 21 我不懂，光排包子行么？
【在 s******y 的大作中提到】
: 等问题解决之后肯定大家都有包子的：）
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m*****z
发帖数: 1451 | 22 check addgene
pTETO-FUW-OSKM
Did you mean this?
【在 s******y 的大作中提到】
: 我倒，我其实就是要转一个普通的老鼠细胞用的。
: 其实。。。我就是不记得那个可以同时转四个蛋白的用来做iPS的质粒叫什么名字了。
: 。。
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s******y
发帖数: 28562 | 23 不是这个。。。我找的那个是发在Nature Cell Biology的，没有Tet-ON promoter, 而
且应该比这个容易克隆一些。这个貌似很多克隆位点都被其他地方用掉了。
不过我倒是可以考虑这个作为option 之一。。。万一哪个审稿者心血来潮要我们做
inducible rescue 的话。。。
【在 m*****z 的大作中提到】
: check addgene
: pTETO-FUW-OSKM
: Did you mean this?
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m*****z
发帖数: 1451 | 24 how about this episomal vector? |
g*********5
发帖数: 2533 | 25 你是不是记错了？这个呢？
Nature Biotechnology 22, 589 - 594 (2004)
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是这个。。。我找的那个是发在Nature Cell Biology的，没有Tet-ON promoter, 而
: 且应该比这个容易克隆一些。这个貌似很多克隆位点都被其他地方用掉了。
: 不过我倒是可以考虑这个作为option 之一。。。万一哪个审稿者心血来潮要我们做
: inducible rescue 的话。。。
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