t****g
发帖数: 120 | 1 正在研究一种被研究得不多的protein, 不少cancer cell line都表达这种蛋白质，但
protein level并不高。 当我overexpress tagged protein之后，发现它能进入
nucleus。 我生物刚入门，不清楚这种能进入nucleus是不是个big deal。 有些疑问：
1） 我用来分cytoplasmic and nuclear proteins的protocol，我的同事质疑我能不能
tell到底这个蛋白质能进nucleus还是membrane. 我用的是在abcam上找到的protocol,
Buffer A (cyto)
10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT,
0.05% NP40 (or 0.05% Igepal or Tergitol) pH 7.9
Buffer B (nucl)
5 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 150mM NaCl
26% glycerol (v/v), pH 7.9
2） 接下来该怎么做？ immunofluorescence? 还是co-IP with the nuclear fraction
to find associated proteins? 可一般用来分nuclear fraction的buffer盐分含量
都很高，没法做IP啊。
希望各位不吝赐教，不胜感激！ 如果有更好的protocol，特别是允许做co-IP的，就更
好了。 |
m******5
发帖数: 1383 | 2 首先，这个蛋白的功能分类是什么 ？ 如果是transcription factor那么进核很正常
主要还是看之前对这个蛋白质的功能分类和报道才知道是不是big deal。
其次，我觉得IF可以放在第一步做，分核质的protocol经常有假阳性假阴性分不干净，反而不如显微镜下看结果可靠。
还有楼主internal control用的是什么？一般用tublin作cyto的control，这个比较可靠。
不过核蛋白control大都不可靠，即使有leakage往往也看不出来 |
t****g
发帖数: 120 | 3 谢谢回复。 这个蛋白是一种tyrosine kinase. 做IF的话我必须要用overexpress的蛋
白，因为细胞本身这种蛋白量很少。 （如果overexpress能进nucleus就能相信原来的
这种蛋白一定能进nucleus吗？）
nuclear internal control用的是lamin A/C。 |
b******s
发帖数: 1089 | 4 transcription factor没有核定位sequence，一般通过什么机制进核？
protein complex还是有未知的signal sequence？
，反而不如显微镜下看结果可靠。
可靠。
【在 m******5 的大作中提到】
: 首先，这个蛋白的功能分类是什么 ？ 如果是transcription factor那么进核很正常
: 主要还是看之前对这个蛋白质的功能分类和报道才知道是不是big deal。
: 其次，我觉得IF可以放在第一步做，分核质的protocol经常有假阳性假阴性分不干净，反而不如显微镜下看结果可靠。
: 还有楼主internal control用的是什么？一般用tublin作cyto的control，这个比较可靠。
: 不过核蛋白control大都不可靠，即使有leakage往往也看不出来
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m******5
发帖数: 1383 | 5 transcription factor 一般都有核定位sequence
【在 b******s 的大作中提到】
: transcription factor没有核定位sequence，一般通过什么机制进核？
: protein complex还是有未知的signal sequence？
:
: ，反而不如显微镜下看结果可靠。
: 可靠。
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b******s
发帖数: 1089 | 6 有很多是没有的。
【在 m******5 的大作中提到】
: transcription factor 一般都有核定位sequence
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m******5
发帖数: 1383 | 7 DNA binding domain很多时候就是NLS
【在 b******s 的大作中提到】
: 有很多是没有的。
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