Z******5
发帖数: 435 | 1 假设有2管质粒a和b，两管质粒的其它序列全部相同，除了某一位点在a中全部
为野生型A；在b中野生型A：突变型G大约为100000:1。
要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢？最好能得到野生型和突变型的比例。
HRM（高分辨率溶解曲线）行不行？检出的灵敏度是多少？
或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来？ |
w******n
发帖数: 767 | 2 PCR可以检测单碱基突变，算比例，我想可以用realtimePCR,但是可能误差很大。
【在 Z******5 的大作中提到】
: 假设有2管质粒a和b，两管质粒的其它序列全部相同，除了某一位点在a中全部
: 为野生型A；在b中野生型A：突变型G大约为100000:1。
: 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢？最好能得到野生型和突变型的比例。
: HRM（高分辨率溶解曲线）行不行？检出的灵敏度是多少？
: 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来？
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A********0
发帖数: 3310 | 3 polony
请参考George Church Lab 的这个网页：http://arep.med.harvard.edu/Polonator/
不过这技术要求比较特殊的设备。一般lab不一定有。 |
d*p
发帖数: 534 | 4 最简单办法，转化，稀释，挑单克隆测序，测100个， 看 比率 |
d*p
发帖数: 534 | 5 没有看清你那个 比率 这么 低，deep sequence吧，一个 样品 也就几千块 |
s******s
发帖数: 13035 | 6 有一个很变态的方法，如果你一直要做这样的检测可能有用，
否则你就deep seq吧
这个方法类似的去年好像有一个检查癌症单碱基突变的nature还是
science文章有，为你的改编一下大概是这样：首先PCR把你要的这段
P出来(cycle不要太多), 然后加热退火杂交，因为你的突变型很少，
所以大多数是完美双链，小部分是有一个mismatch的dsDNA. 这个东西
克隆到特定的载体里面，转化有识别mismatch的ecoli. 有mismatch的
就切开修了，顺便把载体里面下游的一个特定结构（比如loop)的致死
或者抗药基因也修掉了；否则不开修，这个转化子活不了。这样，你
spike几个不同比例的control，用转化colony多少做标准曲线就可以估计了
【在 Z******5 的大作中提到】
: 假设有2管质粒a和b，两管质粒的其它序列全部相同，除了某一位点在a中全部
: 为野生型A；在b中野生型A：突变型G大约为100000:1。
: 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢？最好能得到野生型和突变型的比例。
: HRM（高分辨率溶解曲线）行不行？检出的灵敏度是多少？
: 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来？
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l*****a
发帖数: 1431 | |
Z******5
发帖数: 435 | 8 假设有2管质粒a和b，两管质粒的其它序列全部相同，除了某一位点在a中全部
为野生型A；在b中野生型A：突变型G大约为100000:1。
要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢？最好能得到野生型和突变型的比例。
HRM（高分辨率溶解曲线）行不行？检出的灵敏度是多少？
或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来？ |
w******n
发帖数: 767 | 9 PCR可以检测单碱基突变，算比例，我想可以用realtimePCR,但是可能误差很大。
【在 Z******5 的大作中提到】
: 假设有2管质粒a和b，两管质粒的其它序列全部相同，除了某一位点在a中全部
: 为野生型A；在b中野生型A：突变型G大约为100000:1。
: 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢？最好能得到野生型和突变型的比例。
: HRM（高分辨率溶解曲线）行不行？检出的灵敏度是多少？
: 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来？
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A********0
发帖数: 3310 | 10 polony
请参考George Church Lab 的这个网页：http://arep.med.harvard.edu/Polonator/
不过这技术要求比较特殊的设备。一般lab不一定有。 |
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d*p
发帖数: 534 | 11 最简单办法，转化，稀释，挑单克隆测序，测100个， 看 比率 |
d*p
发帖数: 534 | 12 没有看清你那个 比率 这么 低，deep sequence吧，一个 样品 也就几千块 |
s******s
发帖数: 13035 | 13 有一个很变态的方法，如果你一直要做这样的检测可能有用，
否则你就deep seq吧
这个方法类似的去年好像有一个检查癌症单碱基突变的nature还是
science文章有，为你的改编一下大概是这样：首先PCR把你要的这段
P出来(cycle不要太多), 然后加热退火杂交，因为你的突变型很少，
所以大多数是完美双链，小部分是有一个mismatch的dsDNA. 这个东西
克隆到特定的载体里面，转化有识别mismatch的ecoli. 有mismatch的
就切开修了，顺便把载体里面下游的一个特定结构（比如loop)的致死
或者抗药基因也修掉了；否则不开修，这个转化子活不了。这样，你
spike几个不同比例的control，用转化colony多少做标准曲线就可以估计了
【在 Z******5 的大作中提到】
: 假设有2管质粒a和b，两管质粒的其它序列全部相同，除了某一位点在a中全部
: 为野生型A；在b中野生型A：突变型G大约为100000:1。
: 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢？最好能得到野生型和突变型的比例。
: HRM（高分辨率溶解曲线）行不行？检出的灵敏度是多少？
: 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来？
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l*****a
发帖数: 1431 | |
Z******5
发帖数: 435 | 15 我在网上查到一些办法，比如cold PCR富集啥的。
自己试过构建野生型和突变型质粒，然后按照1:1000到1:100梯度稀释，用sybgreen扩
增检测Tm值，然后做标准曲线。 扩增片段80bp，要检测的位点在中间。 发现A到G的突
变Tm值升高了0.5度。G到T的突变Tm值没变化。 然后用梯度稀释的比例值与Tm值做回归
，能得到R方0.95的回归曲线。但是如果加上bar值，各组Tm之间其实根本没有统计差别
。同时又由于用的是ABI7500，又是不饱和染料sybgreen，分辨率也就0.5度，这个方法
也就作罢。
后来尝试在突变位点附件做定点突变PCR，制造出酶切位点（野生型能切，突变型不能
切），结果神奇的发现药物处理第二代后，细胞中积累的突变就有50%至高了，完全不
想一开始自己想象的千分之一、万分之一。 |
l******g
发帖数: 1623 | 16 用COLD-PCR最低监测过0.1%含量的突变，你这个估计要用deep sequencing
【在 Z******5 的大作中提到】
: 假设有2管质粒a和b，两管质粒的其它序列全部相同，除了某一位点在a中全部
: 为野生型A；在b中野生型A：突变型G大约为100000:1。
: 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢？最好能得到野生型和突变型的比例。
: HRM（高分辨率溶解曲线）行不行？检出的灵敏度是多少？
: 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来？
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