Z******5 发帖数: 435 | 1 假设有2管质粒a和b,两管质粒的其它序列全部相同,除了某一位点在a中全部
为野生型A;在b中野生型A:突变型G大约为100000:1。
要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢?最好能得到野生型和突变型的比例。
HRM(高分辨率溶解曲线)行不行?检出的灵敏度是多少?
或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来? |
w******n 发帖数: 767 | 2 PCR可以检测单碱基突变,算比例,我想可以用realtimePCR,但是可能误差很大。
【在 Z******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 假设有2管质粒a和b,两管质粒的其它序列全部相同,除了某一位点在a中全部 : 为野生型A;在b中野生型A:突变型G大约为100000:1。 : 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢?最好能得到野生型和突变型的比例。 : HRM(高分辨率溶解曲线)行不行?检出的灵敏度是多少? : 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来?
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A********0 发帖数: 3310 | 3 polony
请参考George Church Lab 的这个网页:http://arep.med.harvard.edu/Polonator/
不过这技术要求比较特殊的设备。一般lab不一定有。 |
d*p 发帖数: 534 | 4 最简单办法,转化,稀释,挑单克隆测序,测100个, 看 比率 |
d*p 发帖数: 534 | 5 没有看清你那个 比率 这么 低,deep sequence吧,一个 样品 也就几千块 |
s******s 发帖数: 13035 | 6 有一个很变态的方法,如果你一直要做这样的检测可能有用,
否则你就deep seq吧
这个方法类似的去年好像有一个检查癌症单碱基突变的nature还是
science文章有,为你的改编一下大概是这样:首先PCR把你要的这段
P出来(cycle不要太多), 然后加热退火杂交,因为你的突变型很少,
所以大多数是完美双链,小部分是有一个mismatch的dsDNA. 这个东西
克隆到特定的载体里面,转化有识别mismatch的ecoli. 有mismatch的
就切开修了,顺便把载体里面下游的一个特定结构(比如loop)的致死
或者抗药基因也修掉了;否则不开修,这个转化子活不了。这样,你
spike几个不同比例的control,用转化colony多少做标准曲线就可以估计了
【在 Z******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 假设有2管质粒a和b,两管质粒的其它序列全部相同,除了某一位点在a中全部 : 为野生型A;在b中野生型A:突变型G大约为100000:1。 : 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢?最好能得到野生型和突变型的比例。 : HRM(高分辨率溶解曲线)行不行?检出的灵敏度是多少? : 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来?
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l*****a 发帖数: 1431 | |
Z******5 发帖数: 435 | 8 假设有2管质粒a和b,两管质粒的其它序列全部相同,除了某一位点在a中全部
为野生型A;在b中野生型A:突变型G大约为100000:1。
要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢?最好能得到野生型和突变型的比例。
HRM(高分辨率溶解曲线)行不行?检出的灵敏度是多少?
或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来? |
w******n 发帖数: 767 | 9 PCR可以检测单碱基突变,算比例,我想可以用realtimePCR,但是可能误差很大。
【在 Z******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 假设有2管质粒a和b,两管质粒的其它序列全部相同,除了某一位点在a中全部 : 为野生型A;在b中野生型A:突变型G大约为100000:1。 : 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢?最好能得到野生型和突变型的比例。 : HRM(高分辨率溶解曲线)行不行?检出的灵敏度是多少? : 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来?
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A********0 发帖数: 3310 | 10 polony
请参考George Church Lab 的这个网页:http://arep.med.harvard.edu/Polonator/
不过这技术要求比较特殊的设备。一般lab不一定有。 |
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d*p 发帖数: 534 | 11 最简单办法,转化,稀释,挑单克隆测序,测100个, 看 比率 |
d*p 发帖数: 534 | 12 没有看清你那个 比率 这么 低,deep sequence吧,一个 样品 也就几千块 |
s******s 发帖数: 13035 | 13 有一个很变态的方法,如果你一直要做这样的检测可能有用,
否则你就deep seq吧
这个方法类似的去年好像有一个检查癌症单碱基突变的nature还是
science文章有,为你的改编一下大概是这样:首先PCR把你要的这段
P出来(cycle不要太多), 然后加热退火杂交,因为你的突变型很少,
所以大多数是完美双链,小部分是有一个mismatch的dsDNA. 这个东西
克隆到特定的载体里面,转化有识别mismatch的ecoli. 有mismatch的
就切开修了,顺便把载体里面下游的一个特定结构(比如loop)的致死
或者抗药基因也修掉了;否则不开修,这个转化子活不了。这样,你
spike几个不同比例的control,用转化colony多少做标准曲线就可以估计了
【在 Z******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 假设有2管质粒a和b,两管质粒的其它序列全部相同,除了某一位点在a中全部 : 为野生型A;在b中野生型A:突变型G大约为100000:1。 : 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢?最好能得到野生型和突变型的比例。 : HRM(高分辨率溶解曲线)行不行?检出的灵敏度是多少? : 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来?
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l*****a 发帖数: 1431 | |
Z******5 发帖数: 435 | 15 我在网上查到一些办法,比如cold PCR富集啥的。
自己试过构建野生型和突变型质粒,然后按照1:1000到1:100梯度稀释,用sybgreen扩
增检测Tm值,然后做标准曲线。 扩增片段80bp,要检测的位点在中间。 发现A到G的突
变Tm值升高了0.5度。G到T的突变Tm值没变化。 然后用梯度稀释的比例值与Tm值做回归
,能得到R方0.95的回归曲线。但是如果加上bar值,各组Tm之间其实根本没有统计差别
。同时又由于用的是ABI7500,又是不饱和染料sybgreen,分辨率也就0.5度,这个方法
也就作罢。
后来尝试在突变位点附件做定点突变PCR,制造出酶切位点(野生型能切,突变型不能
切),结果神奇的发现药物处理第二代后,细胞中积累的突变就有50%至高了,完全不
想一开始自己想象的千分之一、万分之一。 |
l******g 发帖数: 1623 | 16 用COLD-PCR最低监测过0.1%含量的突变,你这个估计要用deep sequencing
【在 Z******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 假设有2管质粒a和b,两管质粒的其它序列全部相同,除了某一位点在a中全部 : 为野生型A;在b中野生型A:突变型G大约为100000:1。 : 要用什么样的技术才能检测出b中的突变序列呢?最好能得到野生型和突变型的比例。 : HRM(高分辨率溶解曲线)行不行?检出的灵敏度是多少? : 或者有什么办法能够定量的把b中的突变富集起来?
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