v***a
发帖数: 1242 | 1 用PCR检测都是有的，但如果设计primer针对全长的蛋白就大多sample都无法克隆出。
大家遇到过类似的事吗？该如何解决呢？谢谢！ |
b*****o
发帖数: 150 | 2 能不能把如何克隆的说的清楚些，这样的描述很难给你提供帮助呀。 |
I***a
发帖数: 13467 | 3 没看懂，
请把问题讲清楚一点，自己明白问题，别人不明白是没用的。 |
v***a
发帖数: 1242 | 4 抱歉没有讲清楚。情况是这样的：拿不同cDNA sample做模板，PCR一个gene（非全长）
，大部分的sample都能得到一个正确的产物短条带（经过测序验证）。然后想用PCR的
方法得到全长的该gene，设计flank该gene两端的引物后，却几乎得不到任何条带。做
到现在，试了自己的sample，也拿别人做的cDNA试（大约20多个来源不同的cDNA
sample)，只有2个是有条带的。用这2个purify后的PCR产物做transformation都失败了
，所以还需要尝试更多，但又苦于能PCR得到全长的概率很小。在此请教大家。
【在 b*****o 的大作中提到】
: 能不能把如何克隆的说的清楚些，这样的描述很难给你提供帮助呀。
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v***a
发帖数: 1242 | 5 谢谢！重新写了，看看行不？
【在 I***a 的大作中提到】
: 没看懂，
: 请把问题讲清楚一点，自己明白问题，别人不明白是没用的。
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b******n
发帖数: 4225 | 6 先连到T-easy或者Topo等克隆载体上面再做亚克隆吧
你想克隆的片段多大？
【在 v***a 的大作中提到】
: 抱歉没有讲清楚。情况是这样的：拿不同cDNA sample做模板，PCR一个gene（非全长）
: ，大部分的sample都能得到一个正确的产物短条带（经过测序验证）。然后想用PCR的
: 方法得到全长的该gene，设计flank该gene两端的引物后，却几乎得不到任何条带。做
: 到现在，试了自己的sample，也拿别人做的cDNA试（大约20多个来源不同的cDNA
: sample)，只有2个是有条带的。用这2个purify后的PCR产物做transformation都失败了
: ，所以还需要尝试更多，但又苦于能PCR得到全长的概率很小。在此请教大家。
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k******0
发帖数: 1073 | 7 有没有GC rich的片段？如果GC含量局部很高，PCR时就可能出现问题。 |
v***a
发帖数: 1242 | 8 不大，就1200多bp
【在 b******n 的大作中提到】
: 先连到T-easy或者Topo等克隆载体上面再做亚克隆吧
: 你想克隆的片段多大？
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b*****o
发帖数: 150 | 9 1.2kb PCR 应该很容易扩增和克隆的。
不能扩出的原因：
引物设计有问题；amplicon GC含量过高；cDNA来源的组织没有或很低的表达, Go to
UCSC genome browser to check your gene's expression in different tissues,
also you can check your gene's isoforms.
克隆不出来的原因：
要扩增片段的一侧可能有你用来做克隆的酶切位点，建议比较没有切的回收片段和酶切
之后的片段；
建议你连到T载体上，然后测序。 |
v***a
发帖数: 1242 | 10 多谢多谢！
【在 b*****o 的大作中提到】
: 1.2kb PCR 应该很容易扩增和克隆的。
: 不能扩出的原因：
: 引物设计有问题；amplicon GC含量过高；cDNA来源的组织没有或很低的表达, Go to
: UCSC genome browser to check your gene's expression in different tissues,
: also you can check your gene's isoforms.
: 克隆不出来的原因：
: 要扩增片段的一侧可能有你用来做克隆的酶切位点，建议比较没有切的回收片段和酶切
: 之后的片段；
: 建议你连到T载体上，然后测序。
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h**********r
发帖数: 671 | 11 不行就合成一个吧，那怕合成没P出来的那段也行。 |
r******y
发帖数: 21907 | 12 TA cloning测序看看吧 还没有遇到过片断被cleave的问题
【在 v***a 的大作中提到】
: 抱歉没有讲清楚。情况是这样的：拿不同cDNA sample做模板，PCR一个gene（非全长）
: ，大部分的sample都能得到一个正确的产物短条带（经过测序验证）。然后想用PCR的
: 方法得到全长的该gene，设计flank该gene两端的引物后，却几乎得不到任何条带。做
: 到现在，试了自己的sample，也拿别人做的cDNA试（大约20多个来源不同的cDNA
: sample)，只有2个是有条带的。用这2个purify后的PCR产物做transformation都失败了
: ，所以还需要尝试更多，但又苦于能PCR得到全长的概率很小。在此请教大家。
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