v***a 发帖数: 1242 | 1 用PCR检测都是有的,但如果设计primer针对全长的蛋白就大多sample都无法克隆出。
大家遇到过类似的事吗?该如何解决呢?谢谢! |
b*****o 发帖数: 150 | 2 能不能把如何克隆的说的清楚些,这样的描述很难给你提供帮助呀。 |
I***a 发帖数: 13467 | 3 没看懂,
请把问题讲清楚一点,自己明白问题,别人不明白是没用的。 |
v***a 发帖数: 1242 | 4 抱歉没有讲清楚。情况是这样的:拿不同cDNA sample做模板,PCR一个gene(非全长)
,大部分的sample都能得到一个正确的产物短条带(经过测序验证)。然后想用PCR的
方法得到全长的该gene,设计flank该gene两端的引物后,却几乎得不到任何条带。做
到现在,试了自己的sample,也拿别人做的cDNA试(大约20多个来源不同的cDNA
sample),只有2个是有条带的。用这2个purify后的PCR产物做transformation都失败了
,所以还需要尝试更多,但又苦于能PCR得到全长的概率很小。在此请教大家。
【在 b*****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 能不能把如何克隆的说的清楚些,这样的描述很难给你提供帮助呀。
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v***a 发帖数: 1242 | 5 谢谢!重新写了,看看行不?
【在 I***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 没看懂, : 请把问题讲清楚一点,自己明白问题,别人不明白是没用的。
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b******n 发帖数: 4225 | 6 先连到T-easy或者Topo等克隆载体上面再做亚克隆吧
你想克隆的片段多大?
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 抱歉没有讲清楚。情况是这样的:拿不同cDNA sample做模板,PCR一个gene(非全长) : ,大部分的sample都能得到一个正确的产物短条带(经过测序验证)。然后想用PCR的 : 方法得到全长的该gene,设计flank该gene两端的引物后,却几乎得不到任何条带。做 : 到现在,试了自己的sample,也拿别人做的cDNA试(大约20多个来源不同的cDNA : sample),只有2个是有条带的。用这2个purify后的PCR产物做transformation都失败了 : ,所以还需要尝试更多,但又苦于能PCR得到全长的概率很小。在此请教大家。
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k******0 发帖数: 1073 | 7 有没有GC rich的片段?如果GC含量局部很高,PCR时就可能出现问题。 |
v***a 发帖数: 1242 | 8 不大,就1200多bp
【在 b******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 先连到T-easy或者Topo等克隆载体上面再做亚克隆吧 : 你想克隆的片段多大?
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b*****o 发帖数: 150 | 9 1.2kb PCR 应该很容易扩增和克隆的。
不能扩出的原因:
引物设计有问题;amplicon GC含量过高;cDNA来源的组织没有或很低的表达, Go to
UCSC genome browser to check your gene's expression in different tissues,
also you can check your gene's isoforms.
克隆不出来的原因:
要扩增片段的一侧可能有你用来做克隆的酶切位点,建议比较没有切的回收片段和酶切
之后的片段;
建议你连到T载体上,然后测序。 |
v***a 发帖数: 1242 | 10 多谢多谢!
【在 b*****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 1.2kb PCR 应该很容易扩增和克隆的。 : 不能扩出的原因: : 引物设计有问题;amplicon GC含量过高;cDNA来源的组织没有或很低的表达, Go to : UCSC genome browser to check your gene's expression in different tissues, : also you can check your gene's isoforms. : 克隆不出来的原因: : 要扩增片段的一侧可能有你用来做克隆的酶切位点,建议比较没有切的回收片段和酶切 : 之后的片段; : 建议你连到T载体上,然后测序。
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h**********r 发帖数: 671 | 11 不行就合成一个吧,那怕合成没P出来的那段也行。 |
r******y 发帖数: 21907 | 12 TA cloning测序看看吧 还没有遇到过片断被cleave的问题
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 抱歉没有讲清楚。情况是这样的:拿不同cDNA sample做模板,PCR一个gene(非全长) : ,大部分的sample都能得到一个正确的产物短条带(经过测序验证)。然后想用PCR的 : 方法得到全长的该gene,设计flank该gene两端的引物后,却几乎得不到任何条带。做 : 到现在,试了自己的sample,也拿别人做的cDNA试(大约20多个来源不同的cDNA : sample),只有2个是有条带的。用这2个purify后的PCR产物做transformation都失败了 : ,所以还需要尝试更多,但又苦于能PCR得到全长的概率很小。在此请教大家。
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