t*****P
发帖数: 36 | 1 非常大的分子7000bp，PCR不出来
是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
谁有经验，请指教啊 |
m*****z
发帖数: 1451 | 2 还是分段P吧
反转这么大的效率很低
【在 t*****P 的大作中提到】
: 非常大的分子7000bp，PCR不出来
: 是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
: 谁有经验，请指教啊
|
S*********s
发帖数: 304 | 3 从cDNA中clone一个6k的gene
Phusion号称可以，但效率仍然很低。
分了两段，每段3K左右，band非常清晰。
中间加个site,可以做silent mutation,增加可用的site.
【在 t*****P 的大作中提到】
: 非常大的分子7000bp，PCR不出来
: 是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
: 谁有经验，请指教啊
|
E***u
发帖数: 60 | 4 两段p出来以后直接合一起用LA Taq overlapping PCR
不要搞silent mutation了
【在 S*********s 的大作中提到】
: 从cDNA中clone一个6k的gene
: Phusion号称可以，但效率仍然很低。
: 分了两段，每段3K左右，band非常清晰。
: 中间加个site,可以做silent mutation,增加可用的site.
|
T******y
发帖数: 14506 | |
m***y
发帖数: 627 | 6 Roche的long template pcr kit 应该能搞的定，我p6点几kb的一次搞定，估计你的7kb
也压力不大，可以试一下 |
d***y
发帖数: 8536 | |
k*****n
发帖数: 323 | |
s******s
发帖数: 13035 | 9 花钱买吧，也就几百刀。从CDNA里面批太痛苦了，还有一堆mutation.
如果是gDNA也就忍了
【在 t*****P 的大作中提到】
: 非常大的分子7000bp，PCR不出来
: 是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
: 谁有经验，请指教啊
|
s********8
发帖数: 619 | 10 才用phusion P了一个5k的片段,测序了一个克隆,确实是一堆mutation.谁能告诉我为啥
?phusion不是号称high fidelity的么?
【在 s******s 的大作中提到】
: 花钱买吧，也就几百刀。从CDNA里面批太痛苦了，还有一堆mutation.
: 如果是gDNA也就忍了
|
s********8
发帖数: 619 | 11 这个overlapping PCR 怎么做?从来没做过,求科普
【在 E***u 的大作中提到】
: 两段p出来以后直接合一起用LA Taq overlapping PCR
: 不要搞silent mutation了
|
s******s
发帖数: 13035 | 12 商业宣传不能信啊，呵呵。主要是很多是polymorphism还有alternative
splicing, 也就是你的mRNA就是这样的。问题是你不知道哪些是这个，哪些
是pcr造成的
【在 s********8 的大作中提到】
: 才用phusion P了一个5k的片段,测序了一个克隆,确实是一堆mutation.谁能告诉我为啥
: ?phusion不是号称high fidelity的么?
|
l**********1
发帖数: 5204 | 13 LZ please try below (I) to (IV) four strands overlap PCR
your target 7kp=2kp(I)+2kp(II)+2kp(III)+1kp(IV)
if you did not know downstream any conservative sequence information
your 3' RACE can use ligation-anchored PCR
就是用内切酶
//en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
对应的人工引物锚定long mRNA 的3'端 做人工锚定引物
i.e. by NotI it should be inserted to 3'端 5'GC---GGCCGC
from
//en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
Enzyme Source Recognition Sequence Cut
NotI Nocardia otitidis
5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
Reference:
1)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/
2)
http://aem.asm.org/content/75/6/1552.abstract
3)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14660366
from cost concern:
Takara Extra Taq is enough for above 2kp target
//www.clontech.com/takara/FR/Products/PCR_Products/High_Performance_PCR/Ex_Taq_DNA_Polymerase?
sitex=10031:22372:US
last if you try to take 7KP
please try this one
//www.clontech.com/takara/NO/Products/PCR_Products/High_Performance_PCR/LA_Taq_DNA_Polymerase?
sitex=10034:22372:US
if also high GC share
try this one:
//www.clontech.com/takara/NO/Products/PCR_Products/High_Performance_PCR/LA_Taq_DNA_Polymerase_
with_GC_Buffers?sitex=10034:22372:US
【在 t*****P 的大作中提到】
: 非常大的分子7000bp，PCR不出来
: 是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
: 谁有经验，请指教啊
|
s********8
发帖数: 619 | 14 polymorphism不应该造成氨基酸序列改变吧?我说的mutation是引起aa变化的那些,数了
一下,大概每kb有一个这样的mutation.我还没有完全测序我的克隆,但是按这个概率的
话就会有4到5个mutation,这个克隆是做表达用的,不知道会不会有影响,郁闷.
【在 s******s 的大作中提到】
: 商业宣传不能信啊，呵呵。主要是很多是polymorphism还有alternative
: splicing, 也就是你的mRNA就是这样的。问题是你不知道哪些是这个，哪些
: 是pcr造成的
|
