r***n
发帖数: 52 | 1 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
这是怎么回事？
还有，有谁知道 cell signaling的Ab用多少，它没有说明抗体的浓度，只是建议做IP
是1:50， 所以我加了4ul到200ul lysate (500ug), santa cruz normal rabbit IgG
sc-2027是200ug/0.5ml, 所以我加了10ul, suppose 两个都加了4ug Ab, 但是IgG重链
santa cruz 要多很多。
cell signal卖的normal rabbit IgG只是用来做ChIP的，引用的文献也是做的ChIP,不
知道我能不能用？
另外cell signaling actin rabbit monoclonal Ab能不能做negative control?或者不
加任何antibody，就是只加beads做negative control.
先谢谢各位大侠！ | l**********1
发帖数: 5204 | 2 Did you try test the level of leakiness with no isotope label actin?
i mean whether your target even abundantly but still holded entirely intra- cellular tyrosine-
containing protein, such as actin or tubulin:
then your negative control with 35S labeled that also became Immunoprecipitation positively
Details please go to
Protocol full text link:
//webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPCB.ch07.Protein%
20Labeling.pdf
cited :
>For many applications, an important control for surface-labeling experiments
is testing the level of leakiness, or the level of intracellular proteins
labeled by this procedure. One possibility is to immunoprecipitate an
entirely intra- cellular tyrosine-containing protein, such as actin or
tubulin.
Although these are highly abundant proteins, little or no label should be
expected.
species,
reference
【在 r***n 的大作中提到】
: 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
: right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
: negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
: paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
: interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
: 链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
: 果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
: 蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
: 抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
: 这是怎么回事？
| m*****l
发帖数: 28 | 3 和我前不久遇到的问题一样，忍不住站出来说一下。
Santa Cruz 的control IgG 不是真正的normal IgG，和他们的技术人员交流过，是用
废掉的抗体混到一起的。
我后来用Sigma的Normal IgG这个问题就解决了。
good luck!
species,
reference
【在 r***n 的大作中提到】
: 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
: right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
: negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
: paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
: interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
: 链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
: 果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
: 蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
: 抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
: 这是怎么回事？
| r***n
发帖数: 52 | 4 Thanks for your help. Actually, I'm not using isotope to label protein.It's
isotype for antibody control. Because all of papers published with IP
results showed IgG control, which is supposed to be no band of target. But
mine has the same band intensity as IP ones but wash off some after long
time incubation with TBST and detected by another species HRP.
- cellular tyrosine-
Immunoprecipitation positively
experiments
【在 l**********1 的大作中提到】
: Did you try test the level of leakiness with no isotope label actin?
: i mean whether your target even abundantly but still holded entirely intra- cellular tyrosine-
: containing protein, such as actin or tubulin:
: then your negative control with 35S labeled that also became Immunoprecipitation positively
: Details please go to
: Protocol full text link:
: //webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPCB.ch07.Protein%
: 20Labeling.pdf
: cited :
: >For many applications, an important control for surface-labeling experiments
| r***n
发帖数: 52 | 5 really?如果正好有我要IP的蛋白抗体在里面就会在control IgG里出现background, 但
是这种mixed的，它的量应该小很多。我的是刚开始ctrl和target一样多。（5 min X 3
wash）
sigma 的normal IgG 是干粉，是吗？PBS溶？还有关键是不知道cell signaling的Ab是
神马浓度，它只是建议1:50做IP。我假设它是1ug/ul,但是同样量的santa cruz normal
rabbit IgG 重链量是它的10倍左右。
现在我用cell signaling的actin rabbit IgG做isotype control, 不过这个是
monoclonal的，IP的那个是poly的。过两天出结果。
【在 m*****l 的大作中提到】
: 和我前不久遇到的问题一样，忍不住站出来说一下。
: Santa Cruz 的control IgG 不是真正的normal IgG，和他们的技术人员交流过，是用
: 废掉的抗体混到一起的。
: 我后来用Sigma的Normal IgG这个问题就解决了。
: good luck!
:
: species,
: reference
| l**********1
发帖数: 5204 | 6 your that 蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90 kDa
is its N-terminal or C -terminal had autocatalytic function
by his own protein sequence likes proteasome
if that negative control is same to positive control
N terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22183254
C terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
HTTPS://www.uni-hohenheim.de/www260/pdf/planta220.pdf
//www.mitbbs.com/article_t/Biology/31633793.html
15F
species,
reference
【在 r***n 的大作中提到】
: 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
: right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
: negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
: paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
: interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
: 链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
: 果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
: 蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
: 抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
: 这是怎么回事？
| r***n
发帖数: 52 | 7 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
这是怎么回事？
还有，有谁知道 cell signaling的Ab用多少，它没有说明抗体的浓度，只是建议做IP
是1:50， 所以我加了4ul到200ul lysate (500ug), santa cruz normal rabbit IgG
sc-2027是200ug/0.5ml, 所以我加了10ul, suppose 两个都加了4ug Ab, 但是IgG重链
santa cruz 要多很多。
cell signal卖的normal rabbit IgG只是用来做ChIP的，引用的文献也是做的ChIP,不
知道我能不能用？
另外cell signaling actin rabbit monoclonal Ab能不能做negative control?或者不
加任何antibody，就是只加beads做negative control.
先谢谢各位大侠！ | l**********1
发帖数: 5204 | 8 Did you try test the level of leakiness with no isotope label actin?
i mean whether your target even abundantly but still holded entirely intra- cellular tyrosine-
containing protein, such as actin or tubulin:
then your negative control with 35S labeled that also became Immunoprecipitation positively
Details please go to
Protocol full text link:
//webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPCB.ch07.Protein%
20Labeling.pdf
cited :
>For many applications, an important control for surface-labeling experiments
is testing the level of leakiness, or the level of intracellular proteins
labeled by this procedure. One possibility is to immunoprecipitate an
entirely intra- cellular tyrosine-containing protein, such as actin or
tubulin.
Although these are highly abundant proteins, little or no label should be
expected.
species,
reference
【在 r***n 的大作中提到】
: 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
: right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
: negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
: paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
: interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
: 链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
: 果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
: 蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
: 抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
: 这是怎么回事？
| m*****l
发帖数: 28 | 9 和我前不久遇到的问题一样，忍不住站出来说一下。
Santa Cruz 的control IgG 不是真正的normal IgG，和他们的技术人员交流过，是用
废掉的抗体混到一起的。
我后来用Sigma的Normal IgG这个问题就解决了。
good luck!
species,
reference
【在 r***n 的大作中提到】
: 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
: right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
: negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
: paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
: interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
: 链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
: 果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
: 蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
: 抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
: 这是怎么回事？
| r***n
发帖数: 52 | 10 Thanks for your help. Actually, I'm not using isotope to label protein.It's
isotype for antibody control. Because all of papers published with IP
results showed IgG control, which is supposed to be no band of target. But
mine has the same band intensity as IP ones but wash off some after long
time incubation with TBST and detected by another species HRP.
- cellular tyrosine-
Immunoprecipitation positively
experiments
【在 l**********1 的大作中提到】
: Did you try test the level of leakiness with no isotope label actin?
: i mean whether your target even abundantly but still holded entirely intra- cellular tyrosine-
: containing protein, such as actin or tubulin:
: then your negative control with 35S labeled that also became Immunoprecipitation positively
: Details please go to
: Protocol full text link:
: //webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPCB.ch07.Protein%
: 20Labeling.pdf
: cited :
: >For many applications, an important control for surface-labeling experiments
| | | r***n
发帖数: 52 | 11 really?如果正好有我要IP的蛋白抗体在里面就会在control IgG里出现background, 但
是这种mixed的，它的量应该小很多。我的是刚开始ctrl和target一样多。（5 min X 3
wash）
sigma 的normal IgG 是干粉，是吗？PBS溶？还有关键是不知道cell signaling的Ab是
神马浓度，它只是建议1:50做IP。我假设它是1ug/ul,但是同样量的santa cruz normal
rabbit IgG 重链量是它的10倍左右。
现在我用cell signaling的actin rabbit IgG做isotype control, 不过这个是
monoclonal的，IP的那个是poly的。过两天出结果。
【在 m*****l 的大作中提到】
: 和我前不久遇到的问题一样，忍不住站出来说一下。
: Santa Cruz 的control IgG 不是真正的normal IgG，和他们的技术人员交流过，是用
: 废掉的抗体混到一起的。
: 我后来用Sigma的Normal IgG这个问题就解决了。
: good luck!
:
: species,
: reference
| l**********1
发帖数: 5204 | 12 your that 蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90 kDa
is its N-terminal or C -terminal had autocatalytic function
by his own protein sequence likes proteasome
if that negative control is same to positive control
N terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22183254
C terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
HTTPS://www.uni-hohenheim.de/www260/pdf/planta220.pdf
//www.mitbbs.com/article_t/Biology/31633793.html
15F
species,
reference
【在 r***n 的大作中提到】
: 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
: right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
: negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
: paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
: interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
: 链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
: 果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
: 蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
: 抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
: 这是怎么回事？
| s**********a
发帖数: 92 | 13 请问楼主，您的问题解决了么？我遇到了同样的问题。
谢谢！ | o**d
发帖数: 3080 | 14 Santa cruz sucks!!
【在 m*****l 的大作中提到】
: 和我前不久遇到的问题一样，忍不住站出来说一下。
: Santa Cruz 的control IgG 不是真正的normal IgG，和他们的技术人员交流过，是用
: 废掉的抗体混到一起的。
: 我后来用Sigma的Normal IgG这个问题就解决了。
: good luck!
:
: species,
: reference
| c******r
发帖数: 3778 | 15 re
cell signaling有自己的control ab啊？为啥要用sc的？
【在 o**d 的大作中提到】
: Santa cruz sucks!!
| u**********d
发帖数: 573 | 16 这，你确定么？不会这么乱来吧
【在 m*****l 的大作中提到】
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: Santa Cruz 的control IgG 不是真正的normal IgG，和他们的技术人员交流过，是用
: 废掉的抗体混到一起的。
: 我后来用Sigma的Normal IgG这个问题就解决了。
: good luck!
:
: species,
: reference
| u**********d
发帖数: 573 | 17 用GST，GFP等tag的抗体做negative control还是比较常见的。
3
normal
【在 r***n 的大作中提到】
: really?如果正好有我要IP的蛋白抗体在里面就会在control IgG里出现background, 但
: 是这种mixed的，它的量应该小很多。我的是刚开始ctrl和target一样多。（5 min X 3
: wash）
: sigma 的normal IgG 是干粉，是吗？PBS溶？还有关键是不知道cell signaling的Ab是
: 神马浓度，它只是建议1:50做IP。我假设它是1ug/ul,但是同样量的santa cruz normal
: rabbit IgG 重链量是它的10倍左右。
: 现在我用cell signaling的actin rabbit IgG做isotype control, 不过这个是
: monoclonal的，IP的那个是poly的。过两天出结果。
| s****l
发帖数: 395 | 18 我觉得IgG control并不是最严格的IP control,因为不能排除co-IP的蛋白是直接被
secondary antibody拉下来的。最严格的control应该是knockout or knockdown IP蛋
白的control
species,
reference
【在 r***n 的大作中提到】
: 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
: right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
: negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
: paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
: interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
: 链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
: 果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
: 蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
: 抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
: 这是怎么回事？
| g*********5
发帖数: 2533 | 19 damn! they can't do this!
【在 m*****l 的大作中提到】
: 和我前不久遇到的问题一样，忍不住站出来说一下。
: Santa Cruz 的control IgG 不是真正的normal IgG，和他们的技术人员交流过，是用
: 废掉的抗体混到一起的。
: 我后来用Sigma的Normal IgG这个问题就解决了。
: good luck!
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: species,
: reference
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