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Biology版 - 完全依赖proteasome降解的蛋白,谁给介绍几个?
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SOS! immunoprecipitation的negative control?求教一个基础的酶动力学问题
求一篇paper,万分感谢求大家帮我troubleshooting west blot
蛋白降解请教kinase的Km
请教一下关于cycloheximide和actinomycin D这俩抑制剂请推荐In Vitro Transcription / Translation kits
是不是大部分蛋白都是Ub/Proteasome pathway降解的?请教一下有用过MG132的同学们
请教Autophagy的大牛,奎宁(Chloroquine)是抑制剂还是启动Autophagy为什么有些基因只有mRNA表达而没有蛋白表达呢?
有没有蛋白本身是高度ubiquitinated的?primer降解厉害吗
请教一下Ubiquitination酶的浓度高时活性受到抑制
相关话题的讨论汇总
话题: proteasome话题: ub话题: gfp话题: 活性
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1 (共1页)
V***b
发帖数: 3419
1
现在要比较一下在两个细胞里的proteasome活性,这两个细胞太不一样了,proteasome
, lysosome,autophagy的水平都不一样。所以要单纯比较proteasome活性的差异不能
看global protein turn-over。我想到的是观察完全依赖proteasome降解的蛋白,谁能
介绍几个,谢谢。或者有其他的什么手段更好的测定proteasome活性?
a*****u
发帖数: 802
2
proteasome substrates太多了,经典的有p53, cyclinB, HIF1a, HMG CoA reductase2
, Insig1 (忘了是1还是2)。
proteasome有3个active centers建议最直接的方法就是纯化proteasome,用产荧光的
substrates检测其活性。或者简单的用model substrates,其中一个是ub-GFP
m******5
发帖数: 1383
3
纯化proteasome不简单吧?大多数时候都是把20s搞出来然后丢掉19s

reductase2

【在 a*****u 的大作中提到】
: proteasome substrates太多了,经典的有p53, cyclinB, HIF1a, HMG CoA reductase2
: , Insig1 (忘了是1还是2)。
: proteasome有3个active centers建议最直接的方法就是纯化proteasome,用产荧光的
: substrates检测其活性。或者简单的用model substrates,其中一个是ub-GFP

a*****u
发帖数: 802
4
提proteasome还好,简单的话有人在某个subunit上加了tag,IP就是了。想纯,没有
modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过,很麻烦而且需要很多细
胞。
确实,这个问题本身就很复杂,proteasome活性又受19s的影响。
m******5
发帖数: 1383
5
恩,不知道有没有卖细胞系和老鼠的,我记得那个加tag的是酵母最早?

【在 a*****u 的大作中提到】
: 提proteasome还好,简单的话有人在某个subunit上加了tag,IP就是了。想纯,没有
: modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过,很麻烦而且需要很多细
: 胞。
: 确实,这个问题本身就很复杂,proteasome活性又受19s的影响。

m******5
发帖数: 1383
6
不过我叫得LZ的问题没那么复杂吧?
能不能就做个蔗糖梯度然后取26S组分做荧光底物以及泡脚看pattern?
不用走柱子了吧

【在 a*****u 的大作中提到】
: 提proteasome还好,简单的话有人在某个subunit上加了tag,IP就是了。想纯,没有
: modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过,很麻烦而且需要很多细
: 胞。
: 确实,这个问题本身就很复杂,proteasome活性又受19s的影响。

V***b
发帖数: 3419
7
多谢楼上几位。纯化proteasome我看还是尽量避免,因为即便是粗提也不见得可以把
lysesome和autophagosome分出去,而且整个的26S也很难保证完整性,最后问题就复杂
化了。还是飞侠说的model substrates来的直接。
s******y
发帖数: 28562
8
ub-GFP 只能作为参考。因为Ubiquitin 和proteasome 其实不是严格
的紧密联系关系。
如果只是一个支持数据,那么ub-GFP 可以用,
如果是非常重要的结果,那么必须用其他方法来重复这个实验。

【在 V***b 的大作中提到】
: 多谢楼上几位。纯化proteasome我看还是尽量避免,因为即便是粗提也不见得可以把
: lysesome和autophagosome分出去,而且整个的26S也很难保证完整性,最后问题就复杂
: 化了。还是飞侠说的model substrates来的直接。

V***b
发帖数: 3419
9
嗯,是这样。ub-substrate在降解前还要de-ub,所以de-ub的效率也影响proteasome降
解该底物的速度,而且de-ub的酶还很多,针对每个底物还不一样。我想的是最简单的
方法用cell lysate,然后把ub-GFP丢进去,温育一段时间,然后看看底物省多少。如
果ub-GFP加速降解,我至少可以说UPS在这个细胞里活性增强了。不过感觉挺弱的。
我现在正在搞35S pulse-chase看global protein turn-over,但这个细胞的autophagy
和lysesome都变了,试验结果不容易阐述啊。。。就怕reviewer到最后猛踩我一脚,我
就无法翻身了。

【在 s******y 的大作中提到】
: ub-GFP 只能作为参考。因为Ubiquitin 和proteasome 其实不是严格
: 的紧密联系关系。
: 如果只是一个支持数据,那么ub-GFP 可以用,
: 如果是非常重要的结果,那么必须用其他方法来重复这个实验。

r*****t
发帖数: 4793
10
这个怎么样?
Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays
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有没有蛋白本身是高度ubiquitinated的?求大家帮我troubleshooting west blot
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s******y
发帖数: 28562
11
用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub,
否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
所以这个de-ub 不是一个问题。
成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
autophagosome的底物,所以不是那么的特异。
如果这个问题对你们非常重要的话,我建议你用三种方法来重复:
1. uncleavable ub-GFP
2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
3. partially purified proteasome with artificial substrate
然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照

autophagy

【在 V***b 的大作中提到】
: 嗯,是这样。ub-substrate在降解前还要de-ub,所以de-ub的效率也影响proteasome降
: 解该底物的速度,而且de-ub的酶还很多,针对每个底物还不一样。我想的是最简单的
: 方法用cell lysate,然后把ub-GFP丢进去,温育一段时间,然后看看底物省多少。如
: 果ub-GFP加速降解,我至少可以说UPS在这个细胞里活性增强了。不过感觉挺弱的。
: 我现在正在搞35S pulse-chase看global protein turn-over,但这个细胞的autophagy
: 和lysesome都变了,试验结果不容易阐述啊。。。就怕reviewer到最后猛踩我一脚,我
: 就无法翻身了。

e***y
发帖数: 358
12
哪里有好的Proteasome卖?
V***b
发帖数: 3419
13
多谢指点,思路开阔了些。

【在 s******y 的大作中提到】
: 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub,
: 否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
: 所以这个de-ub 不是一个问题。
: 成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
: autophagosome的底物,所以不是那么的特异。
: 如果这个问题对你们非常重要的话,我建议你用三种方法来重复:
: 1. uncleavable ub-GFP
: 2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
: 3. partially purified proteasome with artificial substrate
: 然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照

V***b
发帖数: 3419
14
看上去不错。10毫升一千多刀,成本几块钱吧。买来试试。

【在 r*****t 的大作中提到】
: 这个怎么样?
: Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays

l**********1
发帖数: 5204
15
plus
avoid autocatalytic N terminal or C terminal Ubiquitin/proteasome-GFP
otherwise no positive results from autocatalysis happened.
please refer:
N terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22183254
Proteasomes and protein conjugation across domains of life
(2011)
>These active sites are exposed after autocatalytic removal of N-terminal ...
>site
or
C terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
HTTPS://www.uni-hohenheim.de/www260/pdf/planta220.pdf

【在 s******y 的大作中提到】
: 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub,
: 否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
: 所以这个de-ub 不是一个问题。
: 成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
: autophagosome的底物,所以不是那么的特异。
: 如果这个问题对你们非常重要的话,我建议你用三种方法来重复:
: 1. uncleavable ub-GFP
: 2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
: 3. partially purified proteasome with artificial substrate
: 然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照

a*****u
发帖数: 802
16
问楼主一个问题,如果2个细胞很不一样,我假设genetic background都不一样,那对
比proteasome活性有什么意义呢?因为除了proteasome,估计其他的生理活性也有很大
不同。
回到问题本身,感觉还是用Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays这个kit好些,
因为最直接。用底物都是indirect的方法,而且底物的降解,在proteasome上游还受E1
,E2,E3 adaptor,regulatory partical 一系列cascade的影响,中间那个环节变了,
底物的降解也随之受影响。
V***b
发帖数: 3419
17
genetic background是一样的,就是敲掉了个抑癌基因,结果好多生理功能都变了。
你说的对,我也觉得这个kit不错,受其他影响因素少。

E1

【在 a*****u 的大作中提到】
: 问楼主一个问题,如果2个细胞很不一样,我假设genetic background都不一样,那对
: 比proteasome活性有什么意义呢?因为除了proteasome,估计其他的生理活性也有很大
: 不同。
: 回到问题本身,感觉还是用Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays这个kit好些,
: 因为最直接。用底物都是indirect的方法,而且底物的降解,在proteasome上游还受E1
: ,E2,E3 adaptor,regulatory partical 一系列cascade的影响,中间那个环节变了,
: 底物的降解也随之受影响。

1 (共1页)
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酶的浓度高时活性受到抑制是不是大部分蛋白都是Ub/Proteasome pathway降解的?
那个cycloheximide增加蛋白量的帖被删了,我的答案请教Autophagy的大牛,奎宁(Chloroquine)是抑制剂还是启动Autophagy
gain of function的mutant 会不会被degrade更快些?有没有蛋白本身是高度ubiquitinated的?
关于磷酸化的学术问题请教一下Ubiquitination
SOS! immunoprecipitation的negative control?求教一个基础的酶动力学问题
求一篇paper,万分感谢求大家帮我troubleshooting west blot
蛋白降解请教kinase的Km
请教一下关于cycloheximide和actinomycin D这俩抑制剂请推荐In Vitro Transcription / Translation kits
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话题: proteasome话题: ub话题: gfp话题: 活性