V***b 发帖数: 3419 | 1 现在要比较一下在两个细胞里的proteasome活性,这两个细胞太不一样了,proteasome
, lysosome,autophagy的水平都不一样。所以要单纯比较proteasome活性的差异不能
看global protein turn-over。我想到的是观察完全依赖proteasome降解的蛋白,谁能
介绍几个,谢谢。或者有其他的什么手段更好的测定proteasome活性? |
a*****u 发帖数: 802 | 2 proteasome substrates太多了,经典的有p53, cyclinB, HIF1a, HMG CoA reductase2
, Insig1 (忘了是1还是2)。
proteasome有3个active centers建议最直接的方法就是纯化proteasome,用产荧光的
substrates检测其活性。或者简单的用model substrates,其中一个是ub-GFP |
m******5 发帖数: 1383 | 3 纯化proteasome不简单吧?大多数时候都是把20s搞出来然后丢掉19s
reductase2
【在 a*****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : proteasome substrates太多了,经典的有p53, cyclinB, HIF1a, HMG CoA reductase2 : , Insig1 (忘了是1还是2)。 : proteasome有3个active centers建议最直接的方法就是纯化proteasome,用产荧光的 : substrates检测其活性。或者简单的用model substrates,其中一个是ub-GFP
|
a*****u 发帖数: 802 | 4 提proteasome还好,简单的话有人在某个subunit上加了tag,IP就是了。想纯,没有
modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过,很麻烦而且需要很多细
胞。
确实,这个问题本身就很复杂,proteasome活性又受19s的影响。 |
m******5 发帖数: 1383 | 5 恩,不知道有没有卖细胞系和老鼠的,我记得那个加tag的是酵母最早?
【在 a*****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 提proteasome还好,简单的话有人在某个subunit上加了tag,IP就是了。想纯,没有 : modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过,很麻烦而且需要很多细 : 胞。 : 确实,这个问题本身就很复杂,proteasome活性又受19s的影响。
|
m******5 发帖数: 1383 | 6 不过我叫得LZ的问题没那么复杂吧?
能不能就做个蔗糖梯度然后取26S组分做荧光底物以及泡脚看pattern?
不用走柱子了吧
【在 a*****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 提proteasome还好,简单的话有人在某个subunit上加了tag,IP就是了。想纯,没有 : modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过,很麻烦而且需要很多细 : 胞。 : 确实,这个问题本身就很复杂,proteasome活性又受19s的影响。
|
V***b 发帖数: 3419 | 7 多谢楼上几位。纯化proteasome我看还是尽量避免,因为即便是粗提也不见得可以把
lysesome和autophagosome分出去,而且整个的26S也很难保证完整性,最后问题就复杂
化了。还是飞侠说的model substrates来的直接。 |
s******y 发帖数: 28562 | 8 ub-GFP 只能作为参考。因为Ubiquitin 和proteasome 其实不是严格
的紧密联系关系。
如果只是一个支持数据,那么ub-GFP 可以用,
如果是非常重要的结果,那么必须用其他方法来重复这个实验。
【在 V***b 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多谢楼上几位。纯化proteasome我看还是尽量避免,因为即便是粗提也不见得可以把 : lysesome和autophagosome分出去,而且整个的26S也很难保证完整性,最后问题就复杂 : 化了。还是飞侠说的model substrates来的直接。
|
V***b 发帖数: 3419 | 9 嗯,是这样。ub-substrate在降解前还要de-ub,所以de-ub的效率也影响proteasome降
解该底物的速度,而且de-ub的酶还很多,针对每个底物还不一样。我想的是最简单的
方法用cell lysate,然后把ub-GFP丢进去,温育一段时间,然后看看底物省多少。如
果ub-GFP加速降解,我至少可以说UPS在这个细胞里活性增强了。不过感觉挺弱的。
我现在正在搞35S pulse-chase看global protein turn-over,但这个细胞的autophagy
和lysesome都变了,试验结果不容易阐述啊。。。就怕reviewer到最后猛踩我一脚,我
就无法翻身了。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : ub-GFP 只能作为参考。因为Ubiquitin 和proteasome 其实不是严格 : 的紧密联系关系。 : 如果只是一个支持数据,那么ub-GFP 可以用, : 如果是非常重要的结果,那么必须用其他方法来重复这个实验。
|
r*****t 发帖数: 4793 | 10 这个怎么样?
Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays |
|
|
s******y 发帖数: 28562 | 11 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub,
否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
所以这个de-ub 不是一个问题。
成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
autophagosome的底物,所以不是那么的特异。
如果这个问题对你们非常重要的话,我建议你用三种方法来重复:
1. uncleavable ub-GFP
2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
3. partially purified proteasome with artificial substrate
然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
autophagy
【在 V***b 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 嗯,是这样。ub-substrate在降解前还要de-ub,所以de-ub的效率也影响proteasome降 : 解该底物的速度,而且de-ub的酶还很多,针对每个底物还不一样。我想的是最简单的 : 方法用cell lysate,然后把ub-GFP丢进去,温育一段时间,然后看看底物省多少。如 : 果ub-GFP加速降解,我至少可以说UPS在这个细胞里活性增强了。不过感觉挺弱的。 : 我现在正在搞35S pulse-chase看global protein turn-over,但这个细胞的autophagy : 和lysesome都变了,试验结果不容易阐述啊。。。就怕reviewer到最后猛踩我一脚,我 : 就无法翻身了。
|
e***y 发帖数: 358 | |
V***b 发帖数: 3419 | 13 多谢指点,思路开阔了些。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub, : 否则表达过程中就被抢先cleaved 了。 : 所以这个de-ub 不是一个问题。 : 成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome, : autophagosome的底物,所以不是那么的特异。 : 如果这个问题对你们非常重要的话,我建议你用三种方法来重复: : 1. uncleavable ub-GFP : 2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace : 3. partially purified proteasome with artificial substrate : 然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
|
V***b 发帖数: 3419 | 14 看上去不错。10毫升一千多刀,成本几块钱吧。买来试试。
【在 r*****t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个怎么样? : Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays
|
l**********1 发帖数: 5204 | 15 plus
avoid autocatalytic N terminal or C terminal Ubiquitin/proteasome-GFP
otherwise no positive results from autocatalysis happened.
please refer:
N terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22183254
Proteasomes and protein conjugation across domains of life
(2011)
>These active sites are exposed after autocatalytic removal of N-terminal ...
>site
or
C terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
HTTPS://www.uni-hohenheim.de/www260/pdf/planta220.pdf
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub, : 否则表达过程中就被抢先cleaved 了。 : 所以这个de-ub 不是一个问题。 : 成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome, : autophagosome的底物,所以不是那么的特异。 : 如果这个问题对你们非常重要的话,我建议你用三种方法来重复: : 1. uncleavable ub-GFP : 2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace : 3. partially purified proteasome with artificial substrate : 然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
|
a*****u 发帖数: 802 | 16 问楼主一个问题,如果2个细胞很不一样,我假设genetic background都不一样,那对
比proteasome活性有什么意义呢?因为除了proteasome,估计其他的生理活性也有很大
不同。
回到问题本身,感觉还是用Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays这个kit好些,
因为最直接。用底物都是indirect的方法,而且底物的降解,在proteasome上游还受E1
,E2,E3 adaptor,regulatory partical 一系列cascade的影响,中间那个环节变了,
底物的降解也随之受影响。 |
V***b 发帖数: 3419 | 17 genetic background是一样的,就是敲掉了个抑癌基因,结果好多生理功能都变了。
你说的对,我也觉得这个kit不错,受其他影响因素少。
E1
【在 a*****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 问楼主一个问题,如果2个细胞很不一样,我假设genetic background都不一样,那对 : 比proteasome活性有什么意义呢?因为除了proteasome,估计其他的生理活性也有很大 : 不同。 : 回到问题本身,感觉还是用Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays这个kit好些, : 因为最直接。用底物都是indirect的方法,而且底物的降解,在proteasome上游还受E1 : ,E2,E3 adaptor,regulatory partical 一系列cascade的影响,中间那个环节变了, : 底物的降解也随之受影响。
|