L*****o 发帖数: 48 | 1 以前从来没有研究过retina,实验室也刚涉及,只有我一个人开始摸石头过河。打算做
一些retina whole mount的染色,这几天刚刚试了试分离retina,分离倒是不难,可是
不知道怎么才能得到展平的retina?是分离后立刻对剪四刀,然后才whole mount吗?
还是whole mount之后才剪?剪完后,怎样才能平整的贴到载玻片上?我感觉轻轻一扯
就烂了,根本没法得到paper中展平漂亮的retina. 多谢指点! |
z****u 发帖数: 1007 | |
L*****o 发帖数: 48 | 3 多谢啊。我也看过这个video,可还是有些不明白。
这个video说的是分离retinal pigment epithelium,而一般paper上的retina whole
mount staining应该只是neural retina,而不包括后面的eye cup吧?如何才能把那层
网状的neural retina展平贴片呢?
【在 z****u 的大作中提到】 : 去jove去搜索protocol. : http://www.jove.com/video/2563/dissection-of-a-mouse-eye-for-a- : 我就是在那里学会的。要剪成菊花瓣样子。多少都会有损坏的。
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n***w 发帖数: 2405 | 4 你所有的染色都应该在EP管里进行。此时,retina仍然是杯状(已经从RPE分离了)。
下面你要在dissection scope下面进行,用transfer pipette (前面的尖头剪掉)将液
体吸得差不多,然后把EP管倒置,这个时候retina应该就在盖子里,然后用镊子小心地
将其夹出,放到scope下的slide上,这时,retina应该还是呈现杯状, ganglion cell
layer up.
然后你要做的就是剪4下(一般四下就够了)。随便找个地方先剪一下,这个时候张力
减小,有两个地方就应该贴到slide上了,然后在对称的地方再剪一下,这个时候,一
般整个retina都贴上去了。
然后你在这两个切口90度的地方在各剪一下,所以四个口一般足够了。
至于peripheral的地方要弄平,我习惯直接用镊子,但是鉴于每个人小心程度没有办法
衡量,你也可以用soft brush,小心的弄平。
有什么问题可以再问我。 |
n***w 发帖数: 2405 | 5 可能语言描述不行,我就粗略地画了一下,希望能够帮助你理解。。。。。
cell
【在 n***w 的大作中提到】 : 你所有的染色都应该在EP管里进行。此时,retina仍然是杯状(已经从RPE分离了)。 : 下面你要在dissection scope下面进行,用transfer pipette (前面的尖头剪掉)将液 : 体吸得差不多,然后把EP管倒置,这个时候retina应该就在盖子里,然后用镊子小心地 : 将其夹出,放到scope下的slide上,这时,retina应该还是呈现杯状, ganglion cell : layer up. : 然后你要做的就是剪4下(一般四下就够了)。随便找个地方先剪一下,这个时候张力 : 减小,有两个地方就应该贴到slide上了,然后在对称的地方再剪一下,这个时候,一 : 般整个retina都贴上去了。 : 然后你在这两个切口90度的地方在各剪一下,所以四个口一般足够了。 : 至于peripheral的地方要弄平,我习惯直接用镊子,但是鉴于每个人小心程度没有办法
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m******5 发帖数: 1383 | 6 画得太Q了!
【在 n***w 的大作中提到】 : 可能语言描述不行,我就粗略地画了一下,希望能够帮助你理解。。。。。 : : cell
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L*****o 发帖数: 48 | 7 Thanks a million! It's really helpful.
Another question about the fixation, do you recommend fix before the retina
separation or after? how long?
cell
【在 n***w 的大作中提到】 : 你所有的染色都应该在EP管里进行。此时,retina仍然是杯状(已经从RPE分离了)。 : 下面你要在dissection scope下面进行,用transfer pipette (前面的尖头剪掉)将液 : 体吸得差不多,然后把EP管倒置,这个时候retina应该就在盖子里,然后用镊子小心地 : 将其夹出,放到scope下的slide上,这时,retina应该还是呈现杯状, ganglion cell : layer up. : 然后你要做的就是剪4下(一般四下就够了)。随便找个地方先剪一下,这个时候张力 : 减小,有两个地方就应该贴到slide上了,然后在对称的地方再剪一下,这个时候,一 : 般整个retina都贴上去了。 : 然后你在这两个切口90度的地方在各剪一下,所以四个口一般足够了。 : 至于peripheral的地方要弄平,我习惯直接用镊子,但是鉴于每个人小心程度没有办法
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n***w 发帖数: 2405 | 8 我的standard protocol是:
1. enucleate the eyes
2. slit the cornea, put the eye in the fixative (usually 4% PFA), for 10min
3. remove cornea and lens and vitreous, and put the eyecup (retina+RPE+
sclera, etc) back to the fixative for about 30-40min. 1hour should also work
.
4. wash with PBS and dissect the retina from the eyecup.
5. put the retina to PBSTriton (1%) permeabilize
6. staining part
这个protocol适用于~95%的蛋白染色。
但是如果遇到一些比较tricky的东西,可能需要调整fixative,固定时间,
permeabilization等等。
我推荐分离之前fix,因为那样的话可以保证你的retina的morphology可以保持住,如
果直接分离,retina的杯状一团糟,最后做flatmount的时候要异常小心,即便如此,
也会有不少damage。
retina
【在 L*****o 的大作中提到】 : Thanks a million! It's really helpful. : Another question about the fixation, do you recommend fix before the retina : separation or after? how long? : : cell
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L*****o 发帖数: 48 | 9 非常有用!实在太感谢了!!
10min
work
【在 n***w 的大作中提到】 : 我的standard protocol是: : 1. enucleate the eyes : 2. slit the cornea, put the eye in the fixative (usually 4% PFA), for 10min : 3. remove cornea and lens and vitreous, and put the eyecup (retina+RPE+ : sclera, etc) back to the fixative for about 30-40min. 1hour should also work : . : 4. wash with PBS and dissect the retina from the eyecup. : 5. put the retina to PBSTriton (1%) permeabilize : 6. staining part : 这个protocol适用于~95%的蛋白染色。
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l**********1 发帖数: 5204 | 10 欧也跟着楼主赞一个
ntgxw不愧是US视网膜领域的德才兼备的人士。
Ps: 比那个蒼井空的所谓德艺双馨是一个太阳 一个月亮的light intensity 区别吧 啊
【在 L*****o 的大作中提到】 : 非常有用!实在太感谢了!! : : 10min : work
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j**********l 发帖数: 7 | |
g*********5 发帖数: 2533 | 12 同赞。
希望苍老师前去慰问。
啊
【在 l**********1 的大作中提到】 : 欧也跟着楼主赞一个 : ntgxw不愧是US视网膜领域的德才兼备的人士。 : Ps: 比那个蒼井空的所谓德艺双馨是一个太阳 一个月亮的light intensity 区别吧 啊
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l**********1 发帖数: 5204 | 13 恩 干脆让她移居美国西海岸, 随了ntgxw大师了
作21世纪新新印象派5D 成像画作的模特儿 如何?
【在 g*********5 的大作中提到】 : 同赞。 : 希望苍老师前去慰问。 : : 啊
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