I***a
发帖数: 13467 | 1 抗体是FITC标记的，在普通荧光显微镜下，看得挺好的，想到共聚焦上拍点漂
亮的照片
，结果照片很差劲，模模糊糊的。比普通荧光显微镜下都差很多，是什么原因？
共聚焦用的比较少，没经验。
zeiss LSM 510
先谢谢。 |
m******5
发帖数: 1383 | 2 有具体照片么？
荧光集团的质量也很关键
激发光波长共聚焦要比普通荧光显微镜集中得多，我曾经遇到过一个GFP突变后在共聚
焦下荧光很弱但在普通荧光显微镜下没什么问题的情况。
另外，你们的共聚焦的分辨率调了么？是不是不小心默认在了低分辨率下？ |
v*****s
发帖数: 20290 | 3 焦点/样品漂了。
【在 I***a 的大作中提到】
: 抗体是FITC标记的，在普通荧光显微镜下，看得挺好的，想到共聚焦上拍点漂
: 亮的照片
: ，结果照片很差劲，模模糊糊的。比普通荧光显微镜下都差很多，是什么原因？
: 共聚焦用的比较少，没经验。
: zeiss LSM 510
: 先谢谢。
|
z****u
发帖数: 1007 | 4 confocal 的灵敏度比普通wide field fluorescent 低不少。
很多普通显微镜下看得很清除的到confocal下变弱很多。常见。 |
f******e
发帖数: 125 | 5 共聚焦的灵敏度应该不会比WIDEFIELD 差很多, 具体没比较过, 也很难比, 因为光源,
光路,成像系统都不一样.CONFOCAL 对ALIGNMENT的要求很高, ALIGNMENT 包括激光,
PINHOLE,DICRHOIC MIRROR.
如果你的ALIGNMENT没问题的话, 你可以把PINHOLE打大, 可以提高信号强度. 还可以
AVERAGE 多FRAME 可以提高S/N.
【在 I***a 的大作中提到】
: 抗体是FITC标记的，在普通荧光显微镜下，看得挺好的，想到共聚焦上拍点漂
: 亮的照片
: ，结果照片很差劲，模模糊糊的。比普通荧光显微镜下都差很多，是什么原因？
: 共聚焦用的比较少，没经验。
: zeiss LSM 510
: 先谢谢。
|
s******y
发帖数: 28562 | 6 听起来就是你没有对好焦，或者没有选对正确的section
我建议你最好先请一个有经验的人帮你照几张。
多照几个z stepping, 挑个最漂亮的来用。
实在不行，照完后先来个maximum projection，看看是不是还是模糊。如果还是
模糊，估计就是什么地方出问题了（比方说镜头或者激光没有align 好，或者你
那批样品没有染好）
【在 I***a 的大作中提到】
: 抗体是FITC标记的，在普通荧光显微镜下，看得挺好的，想到共聚焦上拍点漂
: 亮的照片
: ，结果照片很差劲，模模糊糊的。比普通荧光显微镜下都差很多，是什么原因？
: 共聚焦用的比较少，没经验。
: zeiss LSM 510
: 先谢谢。
|
I***a
发帖数: 13467 | 7 这是图，
处理过，差不多了
【在 m******5 的大作中提到】
: 有具体照片么？
: 荧光集团的质量也很关键
: 激发光波长共聚焦要比普通荧光显微镜集中得多，我曾经遇到过一个GFP突变后在共聚
: 焦下荧光很弱但在普通荧光显微镜下没什么问题的情况。
: 另外，你们的共聚焦的分辨率调了么？是不是不小心默认在了低分辨率下？
|
s*****j
发帖数: 6435 | 8 用的油镜? 不会是进去气泡了吧?
【在 I***a 的大作中提到】
: 抗体是FITC标记的，在普通荧光显微镜下，看得挺好的，想到共聚焦上拍点漂
: 亮的照片
: ，结果照片很差劲，模模糊糊的。比普通荧光显微镜下都差很多，是什么原因？
: 共聚焦用的比较少，没经验。
: zeiss LSM 510
: 先谢谢。
|
s*****j
发帖数: 6435 | 9 "激发光波长共聚焦要比普通荧光显微镜集中得多"
什么"集中得多"?
【在 m******5 的大作中提到】
: 有具体照片么？
: 荧光集团的质量也很关键
: 激发光波长共聚焦要比普通荧光显微镜集中得多，我曾经遇到过一个GFP突变后在共聚
: 焦下荧光很弱但在普通荧光显微镜下没什么问题的情况。
: 另外，你们的共聚焦的分辨率调了么？是不是不小心默认在了低分辨率下？
|
l**********1
发帖数: 5204 | 10 视野变小了吧
既要共聚焦 又要广视野的话 价格不一般哦
就像相机的
全幅的佳能5D 成了半幅的佳能550D 机体价格就差五倍 不包佳能特配大炮镜头(一个镜头比5D 机体还贵一倍呢 )
please go to
[谈天说地] 国外权威杂志热评 史上最伟大50台相机
//bbs.powerapple.com/forum.php?mod=viewthread&tid=989277
【在 s*****j 的大作中提到】
: "激发光波长共聚焦要比普通荧光显微镜集中得多"
: 什么"集中得多"?
|
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c*********r
发帖数: 1312 | 11 盖玻片和镜头是匹配的吗？我遇到过盖玻片太薄或太厚，或者镜头与样本距离太远被盖
玻片挡住了时，背景噪音很大的情况。
【在 I***a 的大作中提到】
: 这是图，
: 处理过，差不多了
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l**********1
发帖数: 5204 | 12 楼主是个半路出家搞Laser scanning confocal microscope (LSCM) 的?
好好看下红宝书/圣经吧
//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142727.mb1410s44/abstract
free download link is here:
//webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPMB.Ch.14.Situ.IHC.pdf
its pp146
UNIT 14.11
Basic Confocal Microscopy
by Carolyn L. Smith
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Bethesda, Maryland
and
//www.olympusconfocal.com/theory/signaltonoise.html
//micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/confocal/index.html
【在 I***a 的大作中提到】
: 这是图，
: 处理过，差不多了
|
s*****j
发帖数: 6435 | 13 视野和confocal有什么关系?
5x的objective就不能confocal了?
个镜头比5D 机体还贵一倍呢 )
【在 l**********1 的大作中提到】
: 视野变小了吧
: 既要共聚焦 又要广视野的话 价格不一般哦
: 就像相机的
: 全幅的佳能5D 成了半幅的佳能550D 机体价格就差五倍 不包佳能特配大炮镜头(一个镜头比5D 机体还贵一倍呢 )
: please go to
: [谈天说地] 国外权威杂志热评 史上最伟大50台相机
:
: //bbs.powerapple.com/forum.php?mod=viewthread&tid=989277
|
s*****j
发帖数: 6435 | 14 你这个外行. 搞confocal的都知道圣经是
james pawley 编的 handbook of biological confocal microscopy
Maryland
【在 l**********1 的大作中提到】
: 楼主是个半路出家搞Laser scanning confocal microscope (LSCM) 的?
: 好好看下红宝书/圣经吧
: //onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142727.mb1410s44/abstract
: free download link is here:
: //webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPMB.Ch.14.Situ.IHC.pdf
: its pp146
: UNIT 14.11
: Basic Confocal Microscopy
: by Carolyn L. Smith
: 1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Bethesda, Maryland
|
l**********1
发帖数: 5204 | 15 看图
摘自那本CLSM 圣经
【在 I***a 的大作中提到】
: 这是图，
: 处理过，差不多了
|
l**********1
发帖数: 5204 | 16 那不是没免费下载的点吗 megaupload dead了后
摘自那本CLSM 圣经 free download ok now.
its pp158:
Image processing
Confocal images can be enhanced by
an image processing technique known as
“deconvolution” or “restoration” (Cannell
et al., 2006; Holmes et al., 2006). The purpose
of deconvolution is to remove the blur caused
by diffraction. By measuring or approximating
the point spread function of the optics, one
can mathematically “work backwards” to account
for the distorting effects of the optics on
the true image. Deconvolution improves contrast
and resolution and reduces noise. Several
algorithms for deconvolution have been devised
that differ in computational intensity and
the extent to which they are quantitative (i.e.,
retain intensity information). The importance
of eliminating noise for quantitative imaging
with confocal microscopy is discussed in detail
by Pawley (2006).Although deconvolution
is the most robust method for reducing noise,
it is computationally intensive. An alternative
and quicker method for reducing noise is to
perform a linear deblurring operation (Russ,
2002).
【在 s*****j 的大作中提到】
: 你这个外行. 搞confocal的都知道圣经是
: james pawley 编的 handbook of biological confocal microscopy
:
: Maryland
|
I***a
发帖数: 13467 | 17 不是专门搞LSCM的，
只想搞几张张好点的图，
Maryland
【在 l**********1 的大作中提到】
: 楼主是个半路出家搞Laser scanning confocal microscope (LSCM) 的?
: 好好看下红宝书/圣经吧
: //onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142727.mb1410s44/abstract
: free download link is here:
: //webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPMB.Ch.14.Situ.IHC.pdf
: its pp146
: UNIT 14.11
: Basic Confocal Microscopy
: by Carolyn L. Smith
: 1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Bethesda, Maryland
|
I***a
发帖数: 13467 | 18 问题别人只是模糊一点，
我的都是噪点啊
【在 l**********1 的大作中提到】
: 看图
: 摘自那本CLSM 圣经
|
l**********1
发帖数: 5204 | 19 look a lo
数据说话
【在 s*****j 的大作中提到】
: 你这个外行. 搞confocal的都知道圣经是
: james pawley 编的 handbook of biological confocal microscopy
:
: Maryland
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l**********1
发帖数: 5204 | 20 那本CLSM圣经 free download ok now
its pp157
Illumination intensity
Fluorescence emission increases linearly
with illumination intensity up to a level at
which emission saturates. Optimal signal-tobackground
and signal-to-noise ratios are obtained
with illumination levels well below saturation
(Tsien et al., 2006). The illumination
intensity on a laser-scanning microscope can
be adjusted by operating the laser at submaximal
power and by inserting neutral-density
filters into the light path or varying the transmission
through the AOTF. In general, the best
images are obtained with illumination levels
that are as high as possible without producing
unacceptable rates of photobleaching.
Reducing noise
Confocal images are inherently noisy due
to the statistics of photon emission and limited
quantum efficiency of the detectors (Pawley,
2006). Improved signal-to-noise ratios can be
attained by scanning the specimen at a slower
rate or by scanning multiple times and averaging
the signals. Current LSCMs allow
individual lines in the image to be scanned
repeatedly and averaged. Line averaging generally
produces sharper images than frame averaging
(which averages full frames) because
there is less risk of blurring due to movements
or changes in the specimen.Averaging reduces
noise by a factor of (1/
√
n, where n is the
number of frames or lines averaged), but more
scans will result in more bleaching. Residual
noise can be reduced by image processing (see
below).
Image processing
Confocal images can be enhanced by
an image processing technique known as
“deconvolution” or “restoration” (Cannell
et al., 2006; Holmes et al., 2006). The purpose
of deconvolution is to remove the blur caused
by diffraction. By measuring or approximating
the point spread function of the optics, one
can mathematically “work backwards” to account
for the distorting effects of the optics on
the true image. Deconvolution improves contrast
and resolution and reduces noise. Several
algorithms for deconvolution have been devised
that differ in computational intensity and
the extent to which they are quantitative (i.e.,
retain intensity information). The importance
of eliminating noise for quantitative imaging
with confocal microscopy is discussed in detail
by Pawley (2006).Although deconvolution
is the most robust method for reducing noise,
it is computationally intensive. An alternative
and quicker method for reducing noise is to
perform a linear deblurring operation (Russ,
2002).
【在 I***a 的大作中提到】
: 问题别人只是模糊一点，
: 我的都是噪点啊
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l**********1
发帖数: 5204 | 21 FITC labeling CLSM adjustment method
看图
【在 I***a 的大作中提到】
: 抗体是FITC标记的，在普通荧光显微镜下，看得挺好的，想到共聚焦上拍点漂
: 亮的照片
: ，结果照片很差劲，模模糊糊的。比普通荧光显微镜下都差很多，是什么原因？
: 共聚焦用的比较少，没经验。
: zeiss LSM 510
: 先谢谢。
|
s*****j
发帖数: 6435 | 22 这个是在说视野吗?
【在 l**********1 的大作中提到】
: look a lo
: 数据说话
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s*****j
发帖数: 6435 | 23 你在这放张图没人能帮你, 可能出问题的地方太多了.
找个懂的人陪你去照, 说不定一分钟就搞定了.
【在 I***a 的大作中提到】
: 问题别人只是模糊一点，
: 我的都是噪点啊
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s******y
发帖数: 28562 | 24 对。楼主应该找个有经验的人先帮他照几张，就知道怎么回事了。
【在 s*****j 的大作中提到】
: 你在这放张图没人能帮你, 可能出问题的地方太多了.
: 找个懂的人陪你去照, 说不定一分钟就搞定了.
|
I***a
发帖数: 13467 | 25 是，
在找呢，这不是双管齐下么。
【在 s*****j 的大作中提到】
: 你在这放张图没人能帮你, 可能出问题的地方太多了.
: 找个懂的人陪你去照, 说不定一分钟就搞定了.
|
l**********1
发帖数: 5204 | 26 Mounting the specimen
Selection of a mounting medium should
take into account the type of microscope objective
that will be used to observe the specimen
(see section on Microscope objectives).
In order for an objective to perform optimally,
the mounting medium should have the same
refractive index (RI) as the objective immersion
medium. Mismatches in the refractive indices
produce spherical aberration leading to
loss of light at the detector, as well as decreased
z-axis resolution and incorrect depth
discrimination. Image deterioration caused by
spherical aberration increases with depth into
the specimen; therefore, matching the immersion
and mounting medium refractive indices
is particularly important for thick specimens.
The refractive indices of some commonly used
mounting media are listed in Table 14.11.2.
Mounting media that have refractive indices
close to that of immersion oil (n = 1.51)
include DPX (n = 1.5; ProSciTech) and Permount
(n=1.52; ProSciTech).However, specimens
must be dehydrated prior to mounting
in these media, and dehydration causes
shrinkage and distortion. Moreover, some fluorophores
cannot withstand dehydration. Cells
retain their three dimensional shapes when
they are kept in physiological saline (PBS) or
a mixture of PBS and glycerol (Bacallao et al.,
2006). If the specimen is to be mounted under
a coverglass, it may be necessary to support the
coverglass to avoid damaging the specimen.
Addition of an antioxidant (antifade agent)
to themountingmedium helps to alleviate photobleaching
of synthetic fluorophores such as
those used for immunocytochemistry. One of
the best antifade agents is 100 mg/ml 1,4-
diazabicyclo[2,2,2]octane (DABCO; Sigma;
Bacallao et al., 2006). n-Propyl gallate (Giloh
and Sedat, 1982) and p-phenylenediamine
(PPD; Johnson et al., 1982) are also effective
antifade agents, but the former may cause
dimming of the fluorescence while the latter
may damage the specimen (Bacallao et al.,
2006). A wide variety of mounting media is
available from commercial sources (Biomeda,
Electron Microscopy Sciences, ProSciTech,
Molecular Probes, Vector Laboratories), and
many of these contain antifade agents. It is
wise to check with the fluorophore provider for
recommendations about which mounting media
and antifade agents to use. Antioxidants
do not reduce photobleaching of fluorescent
proteins.
看图
【在 I***a 的大作中提到】
: 抗体是FITC标记的，在普通荧光显微镜下，看得挺好的，想到共聚焦上拍点漂
: 亮的照片
: ，结果照片很差劲，模模糊糊的。比普通荧光显微镜下都差很多，是什么原因？
: 共聚焦用的比较少，没经验。
: zeiss LSM 510
: 先谢谢。
|
I***a
发帖数: 13467 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 28 Merci beaucoup
BAIZI two please.
Ps:
咳 都是包子换paper 给逼的
三个 五个包子没人理
就得十个包子换一篇才立马收到, 啊。
【在 I***a 的大作中提到】
: 转头发包子。
|
b******s
发帖数: 1089 | 29 你这个背景很高，除了楼上说的一些原因外，可能原因还有：
样品stress，导致信号下降，自发荧光上升。
laser强度过高，扫描速度太慢，导致信号被漂白。这种情况下，如果你为了追求信号
把gain调的很高，背景就会相应很高。
【在 I***a 的大作中提到】
: 这是图，
: 处理过，差不多了
|
f******e
发帖数: 125 | 30 CONFOCAL 用的是平行的激光, 光可以被集中到很小一个点,
WIDEFIELD用的是发散的光源, 光斑很大.
【在 l**********1 的大作中提到】
: look a lo
: 数据说话
|
|
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s*****j
发帖数: 6435 | 31 "WIDEFIELD用的是发散的光源,光斑很大."? 乱说.
【在 f******e 的大作中提到】
: CONFOCAL 用的是平行的激光, 光可以被集中到很小一个点,
: WIDEFIELD用的是发散的光源, 光斑很大.
|
b******s
发帖数: 1089 | 32 更正一下。我说错了。这种情况live imaging更普遍。才发现你是固定过的样品。
不好意思。
【在 b******s 的大作中提到】
: 你这个背景很高，除了楼上说的一些原因外，可能原因还有：
: 样品stress，导致信号下降，自发荧光上升。
: laser强度过高，扫描速度太慢，导致信号被漂白。这种情况下，如果你为了追求信号
: 把gain调的很高，背景就会相应很高。
|
I***a
发帖数: 13467 | 33 你的建议很好的，
一开始是用了GFP，做live imaging，结果是同样的情况，以为表达很弱
改用免疫荧光，
【在 b******s 的大作中提到】
: 更正一下。我说错了。这种情况live imaging更普遍。才发现你是固定过的样品。
: 不好意思。
|
f******e
发帖数: 125 | 34 你懂, 你说呀. 好好理解啥叫"WIDEFILED" . 为啥WIDEFILED 不用PMT.
【在 s*****j 的大作中提到】
: "WIDEFIELD用的是发散的光源,光斑很大."? 乱说.
|
p*l
发帖数: 1359 | 35 Wide field image you see will always be better than what you get from
confocal. There are multiple reasons.
First, in wide field you see fluorescence from multiple layers, so the
signal is stronger.
Second, believe it or not, human eye is more sensitive than most PMT and
cameras. Human eye can detect single photon with minimal dark noise if your eyes have stay in dark for a long time. The drawback of human eye is it can only refresh the image 10~20 times per second, and you can't save the image you see into a computer. PMT can detect signal photon if you set the gain to maximal, but under the maximal gain, the signal is usually very noisy. PMTs in commercial confocal microscopes are not of best quality.
Last and the most important, when you look at the sample through the eye
piece, you eyes observe all portions of the sample for quite a long time.
When you scan the sample under confocal, pixels are scanned in the fly. The observation time, or in professional words, the integration time per pixel
is less than a millisecond. Within that short time, the number of photons is
limited.
The advantage of confocal is it removes out of focus background. If you are not bother by the background, you don't need confocal. |
p*l
发帖数: 1359 | 36 If you do confocal a lot, I suggest you keep a stained slide as your control
standard. You can test the control slide first every time under the same
setting. In this way if there is some thing wrong with the scope, you will
know. If there is something wrong with your sample, you will know too.
Invitrogen sells multi-color control slides. They last a long time.
http://tinyurl.com/6t8ue29
【在 I***a 的大作中提到】
: 这是图，
: 处理过，差不多了
|
l**********1
发帖数: 5204 | 37 For LIVE IMAGING
please transfer to LSM 5 Live; Carl Zeiss instrument if your college/university has it.
那本圣经 free download ok now
cited from its pp152
>
A new type of slit-scanning confocal microscope
(LSM 5 Live; Carl Zeiss, Inc.) has
recently been introduced that allows images to
be acquired at rates as fast as or faster than
can be achieved with a spinning-disk confocal
microscope, and with as low or lower rates
of photobleaching. The system adopts principles
from both the spot scanner and the spinning
disk in that it uses a single scanning galvanometer
to move an illumination line that is
combined with a sensitive single-line CCD detector.
The point source of light from the laser
is optically converted to a narrow line, which
is reflected onto the specimen by a novel beam
splitter consisting of a mirrored line on transparent
glass. The line illumination is scanned
across the specimen. The emitted fluorescence
from the specimen that is collected by the objective
passes through the beam splitter and
is detected by a linear CCD detector. A slit
aperture in front of the detector blocks out-offocus
light, analogous to the pinhole aperture
in an LSCM. The LSM 5 Live has somewhat
poorer resolution than a spot-scanning LSCM,
but can capture images much more rapidly.
Ps: or alternatively NIKON A1R CLSM with a number of advanced features, including a high-resolution
galvanometer-based scanner (4,096 x 4,096 pixels; non-resonant) and a high-speed resonant scanner, a
continuously variable hexagonal pinhole, spectral imaging capacity, several optical output ports, and a pair
of input ports for multiple lasers of different wavelengths
//www.microscopyu.com/articles/confocal/resonantscanning.html
USA below
HTTPS//ctsi.mcw.edu/investigator/research-cores-centers/mu/nikon-a1r/
has it too.
具体偶们这里用哪一种设备的信息
站内短你了 IDjia
不要人肉偶啊
【在 I***a 的大作中提到】
: 你的建议很好的，
: 一开始是用了GFP，做live imaging，结果是同样的情况，以为表达很弱
: 改用免疫荧光，
|
l**********1
发帖数: 5204 | 38 BAOZI four got
Merci.
【在 I***a 的大作中提到】
: 转头发包子。
|
l**********1
发帖数: 5204 | 39 别理会那个ID
he/she 是和楼主的开题故意捣乱的 吧?
偶估计是wsn 让华人mm 给off 了 或者是wsnv 让
人家华人MM 给抢了未来的LD了。
比如：Linda Buck her case
please go to
http://www.mitbbs.com/article_t1/Biology/31638425_0_2.html
[ 37th floor
发信人: demoner (给我一块二向箔), 信区: Biology
标 题: Re: 有些女PI真可怕
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Feb 24 18:40:55 2012, 美东)
Cori Bargman是美女又是天才，难怪Richar Axel不要Linda Buck...
她读PhD的时候就跟Bob Weinburg，参与发现Ras在Cancer中的作用，
她做博士后跟Bob Horvitz，发现nematodes在chemosensing的中作用,
后面就就跟Richar Axel谈恋爱，做faculty.
她从博士导师到博后老板到老公，全都是诺贝尔奖级别的人物．生物学圈子里面，还有
比她爽的吗？
当然要温婉，都这么幸运了，有什么必要不温婉吗？
but Buck L. lost BF but got Nobel prize in 2004:
>
Richard Axel (born July 2, 1946, New York City) is an American neuroscientist whose work on the olfactory
system won him and Linda B. Buck, a former post-doctoral scientist in his research group, the Nobel Prize
in Physiology or Medicine in 2004.
//en.wikipedia.org/wiki/Richard_Axel
---- |
s*****j
发帖数: 6435 | 40 其实应该问的问题是为什么 point scan confocal一定要用PMT, 而不是一个 single
pixel的CCD chip. 尽管现在CCD的QE接近1, 而PMT的QE在50%以下. confocal也有用CCD
和水银灯的, 就是你说的什么"发散光源" .
widefiled是指整个 field of view 在同时被激发, 如果你只看某一个特定的点, 光
路和 confocal没有什么区别. 什么叫"光斑变大"? 你和另外一位一样(copy一个有效分
辨率的表来说视野.), 根本就没搞清楚 field of view, kohler illumination,
resolution limit, point spread function 之间的区别.
【在 f******e 的大作中提到】
: 你懂, 你说呀. 好好理解啥叫"WIDEFILED" . 为啥WIDEFILED 不用PMT.
|
|
|
s*****j
发帖数: 6435 | 41 你还是应该把你自己帖得那本"bible"看看再来发言.
【在 l**********1 的大作中提到】
: 别理会那个ID
: he/she 是和楼主的开题故意捣乱的 吧?
: 偶估计是wsn 让华人mm 给off 了 或者是wsnv 让
: 人家华人MM 给抢了未来的LD了。
: 比如：Linda Buck her case
: please go to
: http://www.mitbbs.com/article_t1/Biology/31638425_0_2.html
: [ 37th floor
: 发信人: demoner (给我一块二向箔), 信区: Biology
: 标 题: Re: 有些女PI真可怕
|
s*****j
发帖数: 6435 | 42 invitrogen的slide一两年之后强度会有相当的变化.
最好的是用植物切片的autofluorescene signal, 十年都不会变多少. 可以找那些公
司的rep要, 他们那多的很,
control
【在 p*l 的大作中提到】
: If you do confocal a lot, I suggest you keep a stained slide as your control
: standard. You can test the control slide first every time under the same
: setting. In this way if there is some thing wrong with the scope, you will
: know. If there is something wrong with your sample, you will know too.
: Invitrogen sells multi-color control slides. They last a long time.
: http://tinyurl.com/6t8ue29
|
l**********1
发帖数: 5204 | 43 真人不用点激将法 是不会露脸的
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31638427.html
回复]
[ 3 ]
发信人: IVYtony (村委书记), 信区: Biology
标 题: Re: 大家讨论下, what is the next big question in your field?
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Feb 24 15:29:15 2012, 美东)
I'm sure no one will you tell you their million-dollar questions. If they do
, that's not a million-dollar question for sure.
-----
single
CCD
【在 s*****j 的大作中提到】
: invitrogen的slide一两年之后强度会有相当的变化.
: 最好的是用植物切片的autofluorescene signal, 十年都不会变多少. 可以找那些公
: 司的rep要, 他们那多的很,
:
: control
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s*****j
发帖数: 6435 | 44 想学就多看书.
目标 讨论帖子 也不见了吗?)
【在 l**********1 的大作中提到】
: 真人不用点激将法 是不会露脸的
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31638427.html
: 回复]
: [ 3 ]
: 发信人: IVYtony (村委书记), 信区: Biology
: 标 题: Re: 大家讨论下, what is the next big question in your field?
: 发信站: BBS 未名空间站 (Fri Feb 24 15:29:15 2012, 美东)
: I'm sure no one will you tell you their million-dollar questions. If they do
: , that's not a million-dollar question for sure.
: -----
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l**********1
发帖数: 5204 | 45 thank you so much
//www.spx.arizona.edu/BME630/Lecture%20Public/Confocal%20Microscopy/Webb%
20confocal%20microscopy%20how%20it%20works.pdf
【在 s*****j 的大作中提到】
: 想学就多看书.
:
: 目标 讨论帖子 也不见了吗?)
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l**********1
发帖数: 5204 | 46 没Veteran 您的指点 书名都不知道 免费可以下载的 PDF
now i got it
Thanks a million.
//www.spx.arizona.edu/BME630/Lecture%20Public/Confocal%20Microscopy/Webb%
20confocal%20microscopy%20how%20it%20works.pdf
【在 s*****j 的大作中提到】
: 想学就多看书.
:
: 目标 讨论帖子 也不见了吗?)
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l**********1
发帖数: 5204 | 47 //www.abrf.org/ResearchGroups/LightMicroscopyResearchGroup/Protocols/
ColeetalNatureProtocols2011.pdf
Table 2
single
CCD
【在 s*****j 的大作中提到】
: 想学就多看书.
:
: 目标 讨论帖子 也不见了吗?)
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I***a
发帖数: 13467 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 49 楼主
BAZO two again got
Thank you so much.
还有10th 12th floor revised already from some misleading paste yesterday
please lift up there for get updated Book full text link address.
if you had time should go to below book:
//www.amazon.co.uk/gp/search?index=books&linkCode=qs&keywords=0123740258
Google book link:
//books.google.no/books?id=H--zxc_N-
jMC&printsec=frontcover&hl=no&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false
TROUBLESHOOTING
Troubleshooting advice can be found in Table 2. Additional troubleshooting guidance can be found in
reference 8
Reference
No. 8
Goodwin, P.C. in "Digital Microscopy" 3rd ed., Vol. 81
(eds. Sluder, G. & Wolf, D.E.) 397–413 (Elsevier, 2007).
from Nature Protocols 2011 one paper:
//www.abrf.org/ResearchGroups/LightMicroscopyResearchGroup/Protocols/
ColeetalNatureProtocols2011.pdf
Ps:
我得Systems Biology project 也可能用得到这个LIVING Imaging by CLSMs.
so it is also for here side also.
【在 I***a 的大作中提到】
: 抗体是FITC标记的，在普通荧光显微镜下，看得挺好的，想到共聚焦上拍点漂
: 亮的照片
: ，结果照片很差劲，模模糊糊的。比普通荧光显微镜下都差很多，是什么原因？
: 共聚焦用的比较少，没经验。
: zeiss LSM 510
: 先谢谢。
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l**********1
发帖数: 5204 | 50 CLSMs God Father i am beaten by you.
【在 s*****j 的大作中提到】
: 想学就多看书.
:
: 目标 讨论帖子 也不见了吗?)
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l**********1
发帖数: 5204 | 51 是 老大
//www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Handbook_Biol_Conf_Micr_404
-413.pdf
2008 MIT one PhD Dissertation
//dspace.mit.edu/handle/1721.1/43142
【在 s*****j 的大作中提到】
: 想学就多看书.
:
: 目标 讨论帖子 也不见了吗?)
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f******e
发帖数: 125 | 52 当然了, resolution, PSF 这么高深的东西我们哪明白呀,就您知道single pixel CCD.
在生物版说这些, 唬谁呢.
牛不是装出来的, 装牛装大呼了就成装B了
single
CCD
【在 s*****j 的大作中提到】
: 想学就多看书.
:
: 目标 讨论帖子 也不见了吗?)
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p*l
发帖数: 1359 | 53 我想厚脸皮提醒这位爱学习的同学一句，看你最近的帖子，觉得很多成像技术你也只是
听说而已。这样狂贴各种各样的信息给楼主，未必能帮忙，反而可能把楼主搞晕了。这
个版上confocal高手不少，大家都不太发言主要是因为问题的可能性太多了，瞎出主意
可能反而帮倒忙。楼主想解决问题，就近找个有经验的人更事半功倍。
【在 l**********1 的大作中提到】
: //www.abrf.org/ResearchGroups/LightMicroscopyResearchGroup/Protocols/
: ColeetalNatureProtocols2011.pdf
: Table 2
:
: single
: CCD
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l**********1
发帖数: 5204 | 54 没有搞KO mice rat 以及细胞生物的 借用CLSM的薄厚或pre-PhD需要 看懂MIT psf 相
关的PhD thesis
哪怕是摘要的水平
我是搞理论生物物理的
我贴给自己看呢 记录存档用的。please refer 48th floor bottom message.
谁没事在这多费功夫加时间啊
Anyway, thanks LZ BAOZI and his/her null floor paste.
【在 p*l 的大作中提到】
: 我想厚脸皮提醒这位爱学习的同学一句，看你最近的帖子，觉得很多成像技术你也只是
: 听说而已。这样狂贴各种各样的信息给楼主，未必能帮忙，反而可能把楼主搞晕了。这
: 个版上confocal高手不少，大家都不太发言主要是因为问题的可能性太多了，瞎出主意
: 可能反而帮倒忙。楼主想解决问题，就近找个有经验的人更事半功倍。
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s*****j
发帖数: 6435 | 55 你自己说的widefield里 "光斑变大", 我说你乱说. 你又扯出个什么PMT来.
先来说这个"光斑变大". 这个"光斑"是什么? 衍射光斑?
同样的镜头, 同样的波长, WIDEFIELD里, 入射光也是平行入射. 衍射大小光斑不会变
呀?
CCD.
【在 f******e 的大作中提到】
: 当然了, resolution, PSF 这么高深的东西我们哪明白呀,就您知道single pixel CCD.
: 在生物版说这些, 唬谁呢.
: 牛不是装出来的, 装牛装大呼了就成装B了
:
: single
: CCD
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v*****s
发帖数: 20290 | 56 我印象里，widefield入射光不是平行入射的，而是先聚焦在物镜焦点处，这样出射的
是平行光，不然像你说的衍射光斑大小不变，怎么做到视场内同时激发。
【在 s*****j 的大作中提到】
: 你自己说的widefield里 "光斑变大", 我说你乱说. 你又扯出个什么PMT来.
: 先来说这个"光斑变大". 这个"光斑"是什么? 衍射光斑?
: 同样的镜头, 同样的波长, WIDEFIELD里, 入射光也是平行入射. 衍射大小光斑不会变
: 呀?
:
: CCD.
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w********y
发帖数: 288 | 57 几个人在这里吵些没用的，对人家楼主有什么帮助？都洗洗睡吧。
我说几个可能办法楼主可以参考下：
看样图里的东东奇形怪状的，我也不知道是啥，无所谓。如果你的样品就是长这样，只
是背景噪音太大，那说明聚焦没问题。可以考虑降低detector gain, 降低扫描速率；
如果信号也因此变弱了，可以考虑适当增加pin hole，适当增加laser。还不行就多扫
几张average (LSM直接就有这功能）
如果样品根本不是这样，完全失真了，要么没聚焦好，要么机器需要调试，那还是找懂行的帮着一起看看吧。 |
s*****j
发帖数: 6435 | 58 你说的是每个光源上的点聚焦在物镜后焦点处, 然后经过物镜平行通过sample. 这样
保证了sample被均匀激发. 如果你考虑sample的每个单个点, 可以认为是由一组平行入
射物镜的光线(每条光线来自光源上的不同的点)聚焦在sample上. 这组平行线的衍射光
斑和激光条件下的衍射光斑差别很小. 激光条件下只有一组平行光, WIDEFIELD里有无
穷组这样的平行光, 所以可以做到视场内同时激发.
【在 v*****s 的大作中提到】
: 我印象里，widefield入射光不是平行入射的，而是先聚焦在物镜焦点处，这样出射的
: 是平行光，不然像你说的衍射光斑大小不变，怎么做到视场内同时激发。
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s*****j
发帖数: 6435 | 59 吵的是理论上的问题. 对LZ是没帮助.
不过你说的这堆大实话, 也没什么用.
懂行的帮着一起看看吧。
【在 w********y 的大作中提到】
: 几个人在这里吵些没用的，对人家楼主有什么帮助？都洗洗睡吧。
: 我说几个可能办法楼主可以参考下：
: 看样图里的东东奇形怪状的，我也不知道是啥，无所谓。如果你的样品就是长这样，只
: 是背景噪音太大，那说明聚焦没问题。可以考虑降低detector gain, 降低扫描速率；
: 如果信号也因此变弱了，可以考虑适当增加pin hole，适当增加laser。还不行就多扫
: 几张average (LSM直接就有这功能）
: 如果样品根本不是这样，完全失真了，要么没聚焦好，要么机器需要调试，那还是找懂行的帮着一起看看吧。
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v*****s
发帖数: 20290 | 60 我觉得你这个说法不对。设想一个理想实验，如果是一个点光源放在物镜后焦点处呢。
【在 s*****j 的大作中提到】
: 吵的是理论上的问题. 对LZ是没帮助.
: 不过你说的这堆大实话, 也没什么用.
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: 懂行的帮着一起看看吧。
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