J******9
发帖数: 736 | 1 我很少接触IHC试验，实验室新进一个抗体，老板要求看看阴性、阳性对照的染色情况。
我查询了一下，阴性对照，通常需要做：
1，空白对照（pBS替代一抗）；
2，血清替换对照：同种属动物的正常血清替换一抗；
请问“血清替换对照”，具体怎么做？是不是直接用血清液（原液）添加在组织片上，
或者是需要稀释（用什么稀释？稀释度一般是多少？）
请大拿赐教~！ |
h*******o
发帖数: 4884 | 2 I think all you need is to include an No-primary antibody control.
For example, you have mouse sections, and your primary antibody is rabbit
anti-mouse
for your sample: dilute your primary antibody in your incubation solution (
normally PBST + 5%-10% horse/goat serum), followed by washing. then your 2
nd antibody will be horse/goat anti-rabbit antibody in incubation solution.
For your control: just use your incubation solution without primary antibody
.
This is particularly important if your primary antibody is a mouse anti-
mouse antibody and your tissues were not perfused well.
Residue endogenous mouse IgG may give you false positive data. |
J******9
发帖数: 736 | 3 谢谢。
另外老板还提到一个阻断这个抗原（比如A）的表达，是用A peptide来检测吗？该如何
处理？跟一般的IHC步骤一样吗？仅仅是将peptide替换一抗？
我完全没有概念，谢谢赐教~！ |
D*a
发帖数: 6830 | 4 2楼说的是空白对照，没必要用血清对照。反正我从来不用。
但是还有一个阴性control 很重要，比如你在brain里面KO掉了蛋白A，你隔壁实验室说
他们有一个在肝脏里面看蛋白A是不是被KO掉的抗体。你于是拿过来在brain上试了试，
发现哇，KO和WT都闪闪发光。。。-_-III
这种情况可以出现在空白对照很干净的抗体上。 |
J******9
发帖数: 736 | 5
【在 J******9 的大作中提到】
: 谢谢。
: 另外老板还提到一个阻断这个抗原（比如A）的表达，是用A peptide来检测吗？该如何
: 处理？跟一般的IHC步骤一样吗？仅仅是将peptide替换一抗？
: 我完全没有概念，谢谢赐教~！
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k*****s
发帖数: 63 | 6 你可以做只有二抗的对照
血清稀释对照，大概5%-10%
况。
【在 J******9 的大作中提到】
: 我很少接触IHC试验，实验室新进一个抗体，老板要求看看阴性、阳性对照的染色情况。
: 我查询了一下，阴性对照，通常需要做：
: 1，空白对照（pBS替代一抗）；
: 2，血清替换对照：同种属动物的正常血清替换一抗；
: 请问“血清替换对照”，具体怎么做？是不是直接用血清液（原液）添加在组织片上，
: 或者是需要稀释（用什么稀释？稀释度一般是多少？）
: 请大拿赐教~！
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k*****s
发帖数: 63 | 7 阻断抗原表达这话不严谨，你的意思究竟是？
【在 J******9 的大作中提到】
: 谢谢。
: 另外老板还提到一个阻断这个抗原（比如A）的表达，是用A peptide来检测吗？该如何
: 处理？跟一般的IHC步骤一样吗？仅仅是将peptide替换一抗？
: 我完全没有概念，谢谢赐教~！
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k*****s
发帖数: 63 | 8 一抗里加血清有时候会有意想不到的效果
所以用血清对照有其道理的，有时候可以降低只有二抗时候的非特异染色
【在 D*a 的大作中提到】
: 2楼说的是空白对照，没必要用血清对照。反正我从来不用。
: 但是还有一个阴性control 很重要，比如你在brain里面KO掉了蛋白A，你隔壁实验室说
: 他们有一个在肝脏里面看蛋白A是不是被KO掉的抗体。你于是拿过来在brain上试了试，
: 发现哇，KO和WT都闪闪发光。。。-_-III
: 这种情况可以出现在空白对照很干净的抗体上。
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h*******o
发帖数: 4884 | 9 I don't quite understand what you meant.
My guess is to use peptide pre-absorbed antibody as negative control.
Honestly, I never bothered to take this step in the past.
Guess for a new antibody, it is good to try.
【在 J******9 的大作中提到】
: 谢谢。
: 另外老板还提到一个阻断这个抗原（比如A）的表达，是用A peptide来检测吗？该如何
: 处理？跟一般的IHC步骤一样吗？仅仅是将peptide替换一抗？
: 我完全没有概念，谢谢赐教~！
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n********k
发帖数: 2818 | 10 Controls are important but more important is to know your systems/stuff well
...Otherwise it could still be problematic even with seemingly right
controls...
况。
【在 J******9 的大作中提到】
: 我很少接触IHC试验，实验室新进一个抗体，老板要求看看阴性、阳性对照的染色情况。
: 我查询了一下，阴性对照，通常需要做：
: 1，空白对照（pBS替代一抗）；
: 2，血清替换对照：同种属动物的正常血清替换一抗；
: 请问“血清替换对照”，具体怎么做？是不是直接用血清液（原液）添加在组织片上，
: 或者是需要稀释（用什么稀释？稀释度一般是多少？）
: 请大拿赐教~！
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J******9
发帖数: 736 | 11 谢谢大家，我可能没说清楚，用该抗体的blocking peptide来处理组织片，作为阴性对
照。 |
h********n
发帖数: 4079 | 12 blocking peptide, which can bind with the antibody. You can add the
peptide with the antibody to stain a positive sample. If the signal
disappears, it means the antibody has good specificity. My phd boss think
this is very important.
【在 J******9 的大作中提到】
: 谢谢。
: 另外老板还提到一个阻断这个抗原（比如A）的表达，是用A peptide来检测吗？该如何
: 处理？跟一般的IHC步骤一样吗？仅仅是将peptide替换一抗？
: 我完全没有概念，谢谢赐教~！
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