v***a
发帖数: 1242 | 1 以前只做过一般的dual-labeled 荧光显微镜，包括tissue和培养的细胞染色。请教如
果现用confocal，有什么不一样的地方需要注意吗，可以不改动protocol直接去看否？
比如细胞染色，我一般是用no.1的coverslip养在上面，现在看到paper里有人做
confocal用的是membrane inserts养细胞，还有的人是用的no.1.5的converslip。这些
都该如何选择比较好？fixative的选择有什么注意吗，我一般都不用Paraformaldehyde
，但paper里几乎清一色都是，而且是用ice-cold PFA fix几个小时。可以用RT PFA来
fix比较短的时间吗？
谢谢！ |
s******a
发帖数: 472 | 2 fixative应该主要和你要研究的蛋白有关，不同的蛋白IHC染色可能需要不同的
protocol。
Paraformaldehyde
【在 v***a 的大作中提到】
: 以前只做过一般的dual-labeled 荧光显微镜，包括tissue和培养的细胞染色。请教如
: 果现用confocal，有什么不一样的地方需要注意吗，可以不改动protocol直接去看否？
: 比如细胞染色，我一般是用no.1的coverslip养在上面，现在看到paper里有人做
: confocal用的是membrane inserts养细胞，还有的人是用的no.1.5的converslip。这些
: 都该如何选择比较好？fixative的选择有什么注意吗，我一般都不用Paraformaldehyde
: ，但paper里几乎清一色都是，而且是用ice-cold PFA fix几个小时。可以用RT PFA来
: fix比较短的时间吗？
: 谢谢！
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D*a
发帖数: 6830 | 3 你们confocal没有专人管吗，最简单的是去跟那人聊聊，拍几张看看。 |
v***a
发帖数: 1242 | 4 蛋白在普通荧光上的条件已经做出来了，就是不知道confocal有没有什么特别
【在 s******a 的大作中提到】
: fixative应该主要和你要研究的蛋白有关，不同的蛋白IHC染色可能需要不同的
: protocol。
:
: Paraformaldehyde
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v***a
发帖数: 1242 | 5 在等仪器排期……所以还没见到专门的人
【在 D*a 的大作中提到】
: 你们confocal没有专人管吗，最简单的是去跟那人聊聊，拍几张看看。
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Z****9
发帖数: 738 | |
v***a
发帖数: 1242 | 7 谢谢！
【在 Z****9 的大作中提到】
: no.1.5的converslip
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v***a
发帖数: 1242 | 8 不知道tissue的话要不要做perfusion？
【在 Z****9 的大作中提到】
: no.1.5的converslip
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n********k
发帖数: 2818 | 9 what's the difference between regular IF and confocal then?...
【在 v***a 的大作中提到】
: 蛋白在普通荧光上的条件已经做出来了，就是不知道confocal有没有什么特别
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Z****9
发帖数: 738 | 10 和普通的microscope的最大区别是confocol可以做optical section 通俗点就是可以做
３d重建。比如，有两个荧光团，分别在不同的z position上，普通FL可能区分不出来。
confocol的第二个优点是能利用光学系统的最大分辨率
confocol的bleaching要比普通的microscope快，我知道不同的处理方式会影响
bleaching的速度。如果你按以前的protocol准备标本，bleaching不是问题的话，不一
定需要fellow别人的。
【在 v***a 的大作中提到】
: 不知道tissue的话要不要做perfusion？
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b*********b
发帖数: 64 | 11 如果你很想了解confocal或者更高级的two-photon，下面两篇paper对你会有帮助。
1.Ojcius DM et al.Immunology and the confocal microscope. Res Immunol 1996
2.Cahalan MD et al.Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a
fresh light.Nat Rev Immunol 2002
ZL1999 (胖头猫)提到了confocal和一般fluoresent microscopy的区别，除了有一点我
不太认同，根据我的理解，confocal microscopy的photobleaching问题应该比一般的
fluoresent microscopy要小，因为前者illuminate smaller volume of your sample。
如果你要做的是培养的细胞，你可以不用改protocal，我一般用8-well chamber slide
，这样一张slide上可以有8个samples。coverslip我倒还从来没注意到是no.多少的，
想来应该越薄越好吧，这样光可以少走点路，呵呵，不太清楚。
Tissue的话，我没有比较过confocal和一般fluoresent microscopy，但是我觉得也应
该可以用一样的protocal吧。我觉得protocal应该没啥特别，confocal带给你的是
resolution。
培养细胞的fixation，我用4% PFA，RT 30min。tissue的fixation，看你怎么做，以及
用OCT还是parraffin，OCT对细胞表面marker保存比较好，而intracellular 分子的
staining用paraffin的多。我只用过OCT，我用acetone for fixation。至于需不需要
perfusion，取决于你的蛋白，比如GFP和NK1.1，通常做perfusion+fixation before
harvest your tissue。
Paraformaldehyde
【在 v***a 的大作中提到】
: 以前只做过一般的dual-labeled 荧光显微镜，包括tissue和培养的细胞染色。请教如
: 果现用confocal，有什么不一样的地方需要注意吗，可以不改动protocol直接去看否？
: 比如细胞染色，我一般是用no.1的coverslip养在上面，现在看到paper里有人做
: confocal用的是membrane inserts养细胞，还有的人是用的no.1.5的converslip。这些
: 都该如何选择比较好？fixative的选择有什么注意吗，我一般都不用Paraformaldehyde
: ，但paper里几乎清一色都是，而且是用ice-cold PFA fix几个小时。可以用RT PFA来
: fix比较短的时间吗？
: 谢谢！
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Z****9
发帖数: 738 | 12 confocal用的是PMT detector （大部分），这个的对光的检测效率（quantum
efficiency）在30-40%左右，对red 或者far red的检测效率更低
普通的fluorescent microscopy 用的是CCD 或者EMCCCD，效率在60-70%
confocal由于pinhole的存在，不但屏蔽了out focus的光子，同时也屏蔽了很多有效的
光子。
这两个原因，造成了confocal比普通的fluoresent microscopy的bleaching严重
a
sample。
slide
【在 b*********b 的大作中提到】
: 如果你很想了解confocal或者更高级的two-photon，下面两篇paper对你会有帮助。
: 1.Ojcius DM et al.Immunology and the confocal microscope. Res Immunol 1996
: 2.Cahalan MD et al.Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a
: fresh light.Nat Rev Immunol 2002
: ZL1999 (胖头猫)提到了confocal和一般fluoresent microscopy的区别，除了有一点我
: 不太认同，根据我的理解，confocal microscopy的photobleaching问题应该比一般的
: fluoresent microscopy要小，因为前者illuminate smaller volume of your sample。
: 如果你要做的是培养的细胞，你可以不用改protocal，我一般用8-well chamber slide
: ，这样一张slide上可以有8个samples。coverslip我倒还从来没注意到是no.多少的，
: 想来应该越薄越好吧，这样光可以少走点路，呵呵，不太清楚。
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Z****9
发帖数: 738 | 13 大部分公司（zeiss， Nikon）的objectives对cover slip的厚度是有矫正的，都是用
No. 1.5的cover slip（厚度 0.17 mm）做标准
如果希望成像质量最好，用No. 1.5的cover slip
如果不计较成像质量，1号或者2号都可以
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢！
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n********k
发帖数: 2818 | 14 zeiss， Nikon leica: do they have the adjustable objective to accomendate
different cover slip? I know Nikon has this feature for regular IF...
【在 Z****9 的大作中提到】
: 大部分公司（zeiss， Nikon）的objectives对cover slip的厚度是有矫正的，都是用
: No. 1.5的cover slip（厚度 0.17 mm）做标准
: 如果希望成像质量最好，用No. 1.5的cover slip
: 如果不计较成像质量，1号或者2号都可以
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 Please refer:
scanned Bessel beams in conjunction
with structured illumination and/or two-photon excitation to create thinner
light sheets (<0.5 μm) better suited to three-dimensional (3D) subcellular
imaging
PubMed link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21378978
Planchon TA, Gao L, et al.
Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam
plane illumination.
Nat Methods. 2011 May;8(5):417-
>Abstract
>A key challenge when imaging living cells is how to noninvasively extract
the most spatiotemporal information possible. Unlike popular wide-field and
confocal methods, plane-illumination microscopy limits excitation to the
information-rich vicinity of the focal plane, providing effective optical
sectioning and high speed while minimizing out-of-focus background and
premature photobleaching. Here we used scanned Bessel beams in conjunction
with structured illumination and/or two-photon excitation to create thinner
light sheets (<0.5 μm) better suited to three-dimensional (3D) subcellular
imaging. As demonstrated by imaging the dynamics of mitochondria, filopodia,
membrane ruffles, intracellular vesicles and mitotic chromosomes in live
cells, the microscope currently offers 3D isotropic resolution down to ～0.3
μm, speeds up to nearly 200 image planes per second and the ability to
noninvasively acquire hundreds of 3D data volumes from single living cells
encompassing tens of thousands of image frames.
【在 n********k 的大作中提到】
: zeiss， Nikon leica: do they have the adjustable objective to accomendate
: different cover slip? I know Nikon has this feature for regular IF...
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m*******y
发帖数: 16 | 16 coverslip的厚度是镜头决定的，有的镜头可以调来适应玻璃厚度，你直接问管显微镜
的人
一般说confocal bleach比较快是因为激光汇聚在在焦点上，虽然每次只激发很小的体
积，但是这个体积内的能量密度很大。同样，管显微镜的人肯定会培训你再让你上机的
，他肯定会教你尽量从小的激光功率开始
a
sample。
slide
【在 b*********b 的大作中提到】
: 如果你很想了解confocal或者更高级的two-photon，下面两篇paper对你会有帮助。
: 1.Ojcius DM et al.Immunology and the confocal microscope. Res Immunol 1996
: 2.Cahalan MD et al.Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a
: fresh light.Nat Rev Immunol 2002
: ZL1999 (胖头猫)提到了confocal和一般fluoresent microscopy的区别，除了有一点我
: 不太认同，根据我的理解，confocal microscopy的photobleaching问题应该比一般的
: fluoresent microscopy要小，因为前者illuminate smaller volume of your sample。
: 如果你要做的是培养的细胞，你可以不用改protocal，我一般用8-well chamber slide
: ，这样一张slide上可以有8个samples。coverslip我倒还从来没注意到是no.多少的，
: 想来应该越薄越好吧，这样光可以少走点路，呵呵，不太清楚。
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v***a
发帖数: 1242 | |
b*********b
发帖数: 64 | 18 深度了解了一下，ZL1999 (胖头猫) 和 mammothcy (mammoth) 说的都非常有道理，
Confocal的photobleaching确实比一般fluorescent严重。 |
s*****j
发帖数: 6435 | 19 "confocal由于pinhole的存在，不但屏蔽了out focus的光子，同时也屏蔽了很多有效的
光子。"
pinhole setting 在 1 airy disk size的话, 95%以上的你所谓"有效光子"都会通过
pinhole( scattered 除外). 不存在"屏蔽很多"的问题
【在 Z****9 的大作中提到】
: confocal用的是PMT detector （大部分），这个的对光的检测效率（quantum
: efficiency）在30-40%左右，对red 或者far red的检测效率更低
: 普通的fluorescent microscopy 用的是CCD 或者EMCCCD，效率在60-70%
: confocal由于pinhole的存在，不但屏蔽了out focus的光子，同时也屏蔽了很多有效的
: 光子。
: 这两个原因，造成了confocal比普通的fluoresent microscopy的bleaching严重
:
: a
: sample。
: slide
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s*****j
发帖数: 6435 | 20 一般也就水镜有矫正, refractive index 不 match. 对cover slip thickness 比较
敏感.
油镜很少有矫正的.
【在 n********k 的大作中提到】
: zeiss， Nikon leica: do they have the adjustable objective to accomendate
: different cover slip? I know Nikon has this feature for regular IF...
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