n********k
发帖数: 2818 | 1 Anyone has experience with the Neon system and can comment on it...what about
its comparison to Amax or others... |
s******a
发帖数: 472 | 2 According to Life Technologies, Neo outperforms Amaxa.
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services
about
【在 n********k 的大作中提到】
: Anyone has experience with the Neon system and can comment on it...what about
: its comparison to Amax or others...
|
b******y
发帖数: 627 | 3 People in our lab like it. |
c****b
发帖数: 1230 | 4 solution贵不
【在 b******y 的大作中提到】
: People in our lab like it.
|
n********k
发帖数: 2818 | 5 Thanks...But I am not sure that;s trustable or not...we have been using the
Amax for ys, and it works nicely...however, it is pretty expensive and I am
debating whether I shall switch to Neon for my future lab...THus, I would love to see
some first-hand experience...
Culture/Transfection/Transfection___Selection-Misc/Neon-Transfection-System/neon-vs_-amaxa.html
【在 s******a 的大作中提到】
: According to Life Technologies, Neo outperforms Amaxa.
: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services
:
: about
|
n********k
发帖数: 2818 | 6 So what types of cells are you folks working on and how efficient it is?
Cost? thanks in advance...debating which one I shall order for my future lab
...I have been using Amax for ys but it could get too expensive...
【在 b******y 的大作中提到】
: People in our lab like it.
|
b******y
发帖数: 627 | 7 It turns out that our lab use for AMO transformation into all kinds of
mammalian cell lines. It works much better than lipid-based methods.
Not sure about other types of oligos. Sorry. |
n********k
发帖数: 2818 | 8 AMO?
【在 b******y 的大作中提到】
: It turns out that our lab use for AMO transformation into all kinds of
: mammalian cell lines. It works much better than lipid-based methods.
: Not sure about other types of oligos. Sorry.
|
b******y
发帖数: 627 | |
n********k
发帖数: 2818 | 10 I c, anyone in your group used for plasmids?
BTW, small fragments are much easier to get in...In fact, Fugene HD is very
good for those too. literally 100%...lipofectamine sucks...all those
transfected with siRNA died in my hands...
【在 b******y 的大作中提到】
: antisense morpholino
|
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|
d****d
发帖数: 214 | 11 I tried primary mouse B and T cells, ~50% transfection efficiency for
plasmid DNA and ~100% for small RNA.
I never used Amaxa, but according to someone who used it, Neon is much more
adjustable and controllable.
very
【在 n********k 的大作中提到】
: I c, anyone in your group used for plasmids?
: BTW, small fragments are much easier to get in...In fact, Fugene HD is very
: good for those too. literally 100%...lipofectamine sucks...all those
: transfected with siRNA died in my hands...
|
n********k
发帖数: 2818 | 12 yeah, Amax lacks flexibilities, all you can do is to following the protocols
...but some say it has better efficiency..but if you can get 50% for B and T
cells, I would say that's very good...what about the survival rate? Amax
survival rate is horrible...although the efficiency is very good for our
cells...BTW, how much the reagents cost?
more
【在 d****d 的大作中提到】
: I tried primary mouse B and T cells, ~50% transfection efficiency for
: plasmid DNA and ~100% for small RNA.
: I never used Amaxa, but according to someone who used it, Neon is much more
: adjustable and controllable.
:
: very
|
n********k
发帖数: 2818 | 13 BTW, it seems the consumable are pretty expensive...or as expensive as Amax.
..so how many times do you folks reuse the Tips or at all? And have anyone
figured out the buffer recipes? Otherwise it could get too expensive with
lots of reporter assays and trial and errors...
more
【在 d****d 的大作中提到】
: I tried primary mouse B and T cells, ~50% transfection efficiency for
: plasmid DNA and ~100% for small RNA.
: I never used Amaxa, but according to someone who used it, Neon is much more
: adjustable and controllable.
:
: very
|
d****d
发帖数: 214 | 14 I have not used Neon for a while, but I think 50% survival rate would be
reasonable to expect. Of course you'll need to optimize the voltage,
duration time, and number of pulses.
Our neighbor lab and I changed the tips and buffers ten times less
frequently than suggested by Invitrogen and it still works well. I guess the
company is counting on the consumables for hefty profits. Also we requested
a lot more (free) buffers at the time we purchased the machine.
The main advantage for electroporation transfection would mainly be small
RNA delivery. For large piece of DNA, I still prefer retroviruse-based
method, which is stable transfer and I don't need to worry about the
viability issue.
protocols
T
【在 n********k 的大作中提到】
: yeah, Amax lacks flexibilities, all you can do is to following the protocols
: ...but some say it has better efficiency..but if you can get 50% for B and T
: cells, I would say that's very good...what about the survival rate? Amax
: survival rate is horrible...although the efficiency is very good for our
: cells...BTW, how much the reagents cost?
:
: more
|
n********k
发帖数: 2818 | 15 that helps a lot and thanks a lot...
the
requested
【在 d****d 的大作中提到】
: I have not used Neon for a while, but I think 50% survival rate would be
: reasonable to expect. Of course you'll need to optimize the voltage,
: duration time, and number of pulses.
: Our neighbor lab and I changed the tips and buffers ten times less
: frequently than suggested by Invitrogen and it still works well. I guess the
: company is counting on the consumables for hefty profits. Also we requested
: a lot more (free) buffers at the time we purchased the machine.
: The main advantage for electroporation transfection would mainly be small
: RNA delivery. For large piece of DNA, I still prefer retroviruse-based
: method, which is stable transfer and I don't need to worry about the
|
s********r
发帖数: 312 | 16 neon的公司销售到我们实验室的时候，用一个他们的GFP reporter转ES，我显微镜下一
看果然全亮了。然后我问他们这个质粒多大，结果好像2k都不到。我就给他拿了一个我
做targeting的质粒17k，说你转我这个试试，一个6孔板就基本见不到亮的。。。他很
不好意思的走了，我也感觉有点对不住他。。。 |
n********k
发帖数: 2818 | 17 17k is huge...so have u folks tried something like 5-10k range? I have lots
around that...Amax can do pretty well with 5-10K range...but the survival
rate is low...
【在 s********r 的大作中提到】
: neon的公司销售到我们实验室的时候，用一个他们的GFP reporter转ES，我显微镜下一
: 看果然全亮了。然后我问他们这个质粒多大，结果好像2k都不到。我就给他拿了一个我
: 做targeting的质粒17k，说你转我这个试试，一个6孔板就基本见不到亮的。。。他很
: 不好意思的走了，我也感觉有点对不住他。。。
|
n********k
发帖数: 2818 | 18 BTW, for small RNA, we have great experience with Fugene HD...it is just so
easy and great...
the
requested
【在 d****d 的大作中提到】
: I have not used Neon for a while, but I think 50% survival rate would be
: reasonable to expect. Of course you'll need to optimize the voltage,
: duration time, and number of pulses.
: Our neighbor lab and I changed the tips and buffers ten times less
: frequently than suggested by Invitrogen and it still works well. I guess the
: company is counting on the consumables for hefty profits. Also we requested
: a lot more (free) buffers at the time we purchased the machine.
: The main advantage for electroporation transfection would mainly be small
: RNA delivery. For large piece of DNA, I still prefer retroviruse-based
: method, which is stable transfer and I don't need to worry about the
|
k****o
发帖数: 589 | 19
呵呵，公司开发产品都这样的，用的基本上是GFP，IgG表达这样的系统。用17k的质粒
估计他们这个平台都开发不出来。
这个系统用的solution也和Amaxa一样是按细胞种类区分的吗？
【在 s********r 的大作中提到】
: neon的公司销售到我们实验室的时候，用一个他们的GFP reporter转ES，我显微镜下一
: 看果然全亮了。然后我问他们这个质粒多大，结果好像2k都不到。我就给他拿了一个我
: 做targeting的质粒17k，说你转我这个试试，一个6孔板就基本见不到亮的。。。他很
: 不好意思的走了，我也感觉有点对不住他。。。
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n********k
发帖数: 2818 | 20 It seems Neon uses one buffer for all...
【在 k****o 的大作中提到】
:
: 呵呵，公司开发产品都这样的，用的基本上是GFP，IgG表达这样的系统。用17k的质粒
: 估计他们这个平台都开发不出来。
: 这个系统用的solution也和Amaxa一样是按细胞种类区分的吗？
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s********r
发帖数: 312 | 21 you can contact the company,they will try ur plasmids,or leave machine to
you for a test run
lots
【在 n********k 的大作中提到】
: 17k is huge...so have u folks tried something like 5-10k range? I have lots
: around that...Amax can do pretty well with 5-10K range...but the survival
: rate is low...
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G*****m
发帖数: 198 | 22 there's another serials electroporators by Nepagene of Japan
Very good in vivo performance. seems also good for in vitro
Check that.
the
requested
【在 d****d 的大作中提到】
: I have not used Neon for a while, but I think 50% survival rate would be
: reasonable to expect. Of course you'll need to optimize the voltage,
: duration time, and number of pulses.
: Our neighbor lab and I changed the tips and buffers ten times less
: frequently than suggested by Invitrogen and it still works well. I guess the
: company is counting on the consumables for hefty profits. Also we requested
: a lot more (free) buffers at the time we purchased the machine.
: The main advantage for electroporation transfection would mainly be small
: RNA delivery. For large piece of DNA, I still prefer retroviruse-based
: method, which is stable transfer and I don't need to worry about the
|
s******y
发帖数: 28562 | 23 我对此有类似的问题，就是那些特别大的质粒，大家都是怎么转进去的？
我们有一个14k 的荧光蛋白的质粒，用一般的方法转完之后都必须sorting
一次才能看到30%的荧光细胞。特别麻烦。本来想做一个stable line 的，
可是因为是plasmid 的integration 就不高，根本筛不出来。
而fusion protein construct >10kbp，貌似不太好装到病毒里面去。
我们用的是MEF, 更是一个特别麻烦的细胞，以前用过的Bio-rad 的机器，
一点都不好似，还不如我用lipofectamine Plus 的效率高。
lots
【在 n********k 的大作中提到】
: 17k is huge...so have u folks tried something like 5-10k range? I have lots
: around that...Amax can do pretty well with 5-10K range...but the survival
: rate is low...
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c****b
发帖数: 1230 | 24 Amaxa worked just fine for me when a 17 kb plasmid was transfected to cells
for integration
【在 s******y 的大作中提到】
: 我对此有类似的问题，就是那些特别大的质粒，大家都是怎么转进去的？
: 我们有一个14k 的荧光蛋白的质粒，用一般的方法转完之后都必须sorting
: 一次才能看到30%的荧光细胞。特别麻烦。本来想做一个stable line 的，
: 可是因为是plasmid 的integration 就不高，根本筛不出来。
: 而fusion protein construct >10kbp，貌似不太好装到病毒里面去。
: 我们用的是MEF, 更是一个特别麻烦的细胞，以前用过的Bio-rad 的机器，
: 一点都不好似，还不如我用lipofectamine Plus 的效率高。
:
: lots
|
s******y
发帖数: 28562 | 25 谢谢！
cells
【在 c****b 的大作中提到】
: Amaxa worked just fine for me when a 17 kb plasmid was transfected to cells
: for integration
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g*********5
发帖数: 2533 | 26 I used neon do transfection with plasmid for suspension cells, good!
very
【在 n********k 的大作中提到】
: I c, anyone in your group used for plasmids?
: BTW, small fragments are much easier to get in...In fact, Fugene HD is very
: good for those too. literally 100%...lipofectamine sucks...all those
: transfected with siRNA died in my hands...
|
m******5
发帖数: 1383 | 27 为啥你的target vector能亮？不是有negative selection marker在么
【在 s********r 的大作中提到】
: neon的公司销售到我们实验室的时候，用一个他们的GFP reporter转ES，我显微镜下一
: 看果然全亮了。然后我问他们这个质粒多大，结果好像2k都不到。我就给他拿了一个我
: 做targeting的质粒17k，说你转我这个试试，一个6孔板就基本见不到亮的。。。他很
: 不好意思的走了，我也感觉有点对不住他。。。
|
m******5
发帖数: 1383 | 28 弱弱的建议是在构建上做成 目的蛋白 ires selection marker, 这样活下来的都是表
达你的目的蛋白的
【在 s******y 的大作中提到】
: 我对此有类似的问题，就是那些特别大的质粒，大家都是怎么转进去的？
: 我们有一个14k 的荧光蛋白的质粒，用一般的方法转完之后都必须sorting
: 一次才能看到30%的荧光细胞。特别麻烦。本来想做一个stable line 的，
: 可是因为是plasmid 的integration 就不高，根本筛不出来。
: 而fusion protein construct >10kbp，貌似不太好装到病毒里面去。
: 我们用的是MEF, 更是一个特别麻烦的细胞，以前用过的Bio-rad 的机器，
: 一点都不好似，还不如我用lipofectamine Plus 的效率高。
:
: lots
|
s******a
发帖数: 472 | 29 Same program works fine for small plasmid, but viability decrease
dramatically if I try to electroporate large DNA construct. Why?
cells
【在 c****b 的大作中提到】
: Amaxa worked just fine for me when a 17 kb plasmid was transfected to cells
: for integration
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s******y
发帖数: 28562 | 30 这个已经试过了，没有用，因为那个质粒上是个Kan/Neo selection marker,
太tmd的没用了。因为必须至少选5天才能选出东西来，首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
而且stably integration 本身就是一个非常低概率的事情，如果一开始的transient transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
对于puromycin 这种比较凶狠的药说不定还能选出来，但是我们的那个蛋白
是在别人实验室里拿到的，里面就只有Kan/Neo
【在 m******5 的大作中提到】
: 弱弱的建议是在构建上做成 目的蛋白 ires selection marker, 这样活下来的都是表
: 达你的目的蛋白的
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m******5
发帖数: 1383 | 31 什么细胞啊？ neo很猛的啊,为什么用kan
首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都
因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的
vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细
胞，让我无语得一塌糊涂。
transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个已经试过了，没有用，因为那个质粒上是个Kan/Neo selection marker,
: 太tmd的没用了。因为必须至少选5天才能选出东西来，首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
: 而且stably integration 本身就是一个非常低概率的事情，如果一开始的transient transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
: 对于puromycin 这种比较凶狠的药说不定还能选出来，但是我们的那个蛋白
: 是在别人实验室里拿到的，里面就只有Kan/Neo
|
s******y
发帖数: 28562 | 32 不好意思没有说清楚，在细胞里面是用G418.
我们用的是MEF.
【在 m******5 的大作中提到】
: 什么细胞啊？ neo很猛的啊,为什么用kan
:
: 首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都
: 因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的
: vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细
: 胞，让我无语得一塌糊涂。
: transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
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m******5
发帖数: 1383 | 33 concentration?
我这儿G418一上没抗性的MEF两天就死光了
【在 s******y 的大作中提到】
: 不好意思没有说清楚，在细胞里面是用G418.
: 我们用的是MEF.
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s******y
发帖数: 28562 | 34 具体用多少我忘了。但是我应该是按照说明书试了三种浓度，记忆中前三天根本没有动
静，等到第５天才陆续的有细胞死亡。
而且我好像记得我前老板说那个东西就是那么慢的，所以我后来也就没有去提高浓度
你用多少浓度？后来能选出阳性细胞么？
【在 m******5 的大作中提到】
: concentration?
: 我这儿G418一上没抗性的MEF两天就死光了
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m******5
发帖数: 1383 | 35 不好意思，刚去做实验了
400ug/ml死的一干二净
我出个歪招，如果pmef里integration效率低你可以在ES cell里做个integration，然
后诱导分化，然后immortalize
或者也不用immortalize，诱导分化出来的也够用一阵子了
【在 s******y 的大作中提到】
: 具体用多少我忘了。但是我应该是按照说明书试了三种浓度，记忆中前三天根本没有动
: 静，等到第５天才陆续的有细胞死亡。
: 而且我好像记得我前老板说那个东西就是那么慢的，所以我后来也就没有去提高浓度
: 你用多少浓度？后来能选出阳性细胞么？
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s******y
发帖数: 28562 | 36 嗯。。。从ES 里面诱导。。。这个其实也是一个没有办法时候的办法。
坏处就是ES cell 培养起来比较tricky :) 不过好处也是很明显的，
如果把ES cell搞定了，以后要用一些比较普通的细胞系都可以直接诱导而不需要再
重新把那些细胞系从头再转一次。
这个建议不错，谢谢。
【在 m******5 的大作中提到】
: 不好意思，刚去做实验了
: 400ug/ml死的一干二净
: 我出个歪招，如果pmef里integration效率低你可以在ES cell里做个integration，然
: 后诱导分化，然后immortalize
: 或者也不用immortalize，诱导分化出来的也够用一阵子了
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m******5
发帖数: 1383 | 37 还可以study differntiation 过程中的dynamic post-translation regulation
【在 s******y 的大作中提到】
: 嗯。。。从ES 里面诱导。。。这个其实也是一个没有办法时候的办法。
: 坏处就是ES cell 培养起来比较tricky :) 不过好处也是很明显的，
: 如果把ES cell搞定了，以后要用一些比较普通的细胞系都可以直接诱导而不需要再
: 重新把那些细胞系从头再转一次。
: 这个建议不错，谢谢。
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g*********5
发帖数: 2533 | 38 TRY INSERT PURO CASSET BEFORE THE Neo/kan?
600bp with GBLOCK FROM IDT.
transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在
这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经
试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个已经试过了，没有用，因为那个质粒上是个Kan/Neo selection marker,
: 太tmd的没用了。因为必须至少选5天才能选出东西来，首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
: 而且stably integration 本身就是一个非常低概率的事情，如果一开始的transient transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
: 对于puromycin 这种比较凶狠的药说不定还能选出来，但是我们的那个蛋白
: 是在别人实验室里拿到的，里面就只有Kan/Neo
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s******y
发帖数: 28562 | 39 要改抗性太麻烦了。因为Neo/kan 是真核原核都能用的，要是改成puro 就必须
再找个地方插进一个原核里的基因，会把人烦死的
【在 g*********5 的大作中提到】
: TRY INSERT PURO CASSET BEFORE THE Neo/kan?
: 600bp with GBLOCK FROM IDT.
:
: transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在
: 这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经
: 试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
: transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
|
a*****x
发帖数: 901 | 40 可以用piggybac system共转helper transposase,这样整合几率就很高了。 |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 41 老兄，你有没有helper transposase 啊？
我实在是找不到能在mammalian cells 里面用的helper, JHU 的 Nancy Craig 说因为她
做的那个质粒涉及到版权问题不能给别人用，而Notre Dame 的Malcolm J. Fraser主要是
做果蝇里面用的，他们的清单里（http://piggybac.bio.nd.edu/）
唯一一个貌似能够在mammalian cell 里面用的helper 是 p3xP3-DsRed1-orf （ The
CMV promoter driven piggyBac ORF helper plasmid. Also contains a 3xP3
controlled DsRed1 genetic maker）。
但是我们要转进去的蛋白正好也是红色的，我不知道这个helper 会不会把它自己的质
粒包括DsRed1 genetic maker 也一道stably转进去？如果也会的话那我们就不能用了！
【在 a*****x 的大作中提到】
: 可以用piggybac system共转helper transposase,这样整合几率就很高了。
|
a*****x
发帖数: 901 | |
s******y
发帖数: 28562 | 43 谢谢，但是那个文章里说的那个方法需要重新做克隆。我们的那个质粒太大，实在是没
有勇气
再重新克隆一次。
另外，piggybac 是否需要特异的识别序列？我想要的其实就是一个能够增强随机插入
的helper 而已，如果要插入的基因需要特别的识别序列的话又得再做克隆。。。
【在 a*****x 的大作中提到】
: I don't have it. But you may check this paper:
: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1934590909003
|
a*****x
发帖数: 901 | 44 piggybac是随机插入。克隆到piggybac质粒应该不难，就是酶切再连接。难道你已有的
质粒没有多克隆位点了？helper质粒你应该可以问那个发文章的实验室要到。
在 sunnyday (飞鱼) 的大作中提到: 】 |
s******y
发帖数: 28562 | 45 要再克隆会非常麻烦，因为需要把promoter 和poly-A tail 都克隆进去，一方面是会
非常
大,另外一方面是可能会找不到任何合适的酶切位置（因为promoter 和poly-A tail 外
围的酶切位置本来就不多，就算有也很可能正好在我们的fusion protein 上同时也有
切点，另外还要看是否和piggybac里面的克隆位置compatible，实在是不看好。
我更感兴趣的是：如果我的质粒不在那个piggay vector 上，光是表达helper
transposase，
能否增进我的那个质粒的随机插入几率？
【在 a*****x 的大作中提到】
: piggybac是随机插入。克隆到piggybac质粒应该不难，就是酶切再连接。难道你已有的
: 质粒没有多克隆位点了？helper质粒你应该可以问那个发文章的实验室要到。
: 在 sunnyday (飞鱼) 的大作中提到: 】
|
a*****x
发帖数: 901 | 46 No, that won't work, at least in theory. You may insert the piggybac
sequence into your vector then -- should not be hard. Or you may try more
transferring conditions |
s********r
发帖数: 312 | 47 piggybac真心好用，用lipo共转mES连克隆都不用挑，有了它以后再也不用做
electroporation了。。 |
s******y
发帖数: 28562 | 48 我本来都已经打算不用了。。。听你这么一说，又让我的兴趣上来了。
你们的piggybac 系统哪里要来的？克隆plasmid的时候怎么处理的？
【在 s********r 的大作中提到】
: piggybac真心好用，用lipo共转mES连克隆都不用挑，有了它以后再也不用做
: electroporation了。。
|
a*****x
发帖数: 901 | |
s******y
发帖数: 28562 | 50 因为听了你说的，觉得又要重新做DNA克隆挺麻烦的。
但是如果效率特别高的话，也许我忍一忍就把那个clonging 做了吧。。。
【在 a*****x 的大作中提到】
: 原来你都打算不用了，浪费我一片苦心那。。。
|
|
|
A******y
发帖数: 2041 | 51 Anyone has experience with MV4-11 AML cell line? Amaxa p-max ctrl plasmid
work great (4k), but all my coding plasmid (~9 to 10k) can not even get in.
I want to adjust the program but don't know which one to adjust to. |
s********r
发帖数: 312 | 52 我们实验室的是国内的一个postdoc自己带来的，这边好像SBI卖的有。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我本来都已经打算不用了。。。听你这么一说，又让我的兴趣上来了。
: 你们的piggybac 系统哪里要来的？克隆plasmid的时候怎么处理的？
|
l**********1
发帖数: 5204 | 53 Re:
sunnyday
please send mail or Fax to
AP Sumiyama K. the corresponding author for
paper:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20219670
ask for his help about your above questions.
his lab:
//sayer.lab.nig.ac.jp/~sumiyama/index-e.html
or
//www.nig.ac.jp/section/saitou/saitou-e.html
or
//sayer.lab.nig.ac.jp/index-e.html
You can also ask him for sending this one:
pT2AL200R150G
by Fedex
of course you told him your US side Fedex receive account number and your side pays
all transportation charge.
more please go to:
//kawakami.lab.nig.ac.jp/map1.html
//kawakami.lab.nig.ac.jp/seq1.html
or
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16959904
or
//kawakami.lab.nig.ac.jp/trans.html
or
//www.sars.no/research/susterPubs.php
回复]
[ 52 ]
发信人: sharkliver (鲨鱼肝), 信区: Biology
标 题: Re: Invitrogen Neon electorporation system?
发信站: BBS 未名空间站 (Mon May 7 17:10:32 2012, 美东)
我们实验室的是国内的一个postdoc自己带来的，这边好像SBI卖的有。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我本来都已经打算不用了。。。听你这么一说，又让我的兴趣上来了。
: 你们的piggybac 系统哪里要来的？克隆plasmid的时候怎么处理的？
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g*********5
发帖数: 2533 | 54 you are right.
small kit 25rxn about 400 dollar?
Amax.
【在 n********k 的大作中提到】
: BTW, it seems the consumable are pretty expensive...or as expensive as Amax.
: ..so how many times do you folks reuse the Tips or at all? And have anyone
: figured out the buffer recipes? Otherwise it could get too expensive with
: lots of reporter assays and trial and errors...
:
: more
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g*********5
发帖数: 2533 | 55 sunny, could you try to replace the Kan/Neo with puromycin
with Gibson fragment?
transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在
这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经
试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个已经试过了，没有用，因为那个质粒上是个Kan/Neo selection marker,
: 太tmd的没用了。因为必须至少选5天才能选出东西来，首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
: 而且stably integration 本身就是一个非常低概率的事情，如果一开始的transient transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
: 对于puromycin 这种比较凶狠的药说不定还能选出来，但是我们的那个蛋白
: 是在别人实验室里拿到的，里面就只有Kan/Neo
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g*********5
发帖数: 2533 | 56 design a pair primers to amplify your vector,
order gibson fragment from IDT.
【在 s******y 的大作中提到】
: 要再克隆会非常麻烦，因为需要把promoter 和poly-A tail 都克隆进去，一方面是会
: 非常
: 大,另外一方面是可能会找不到任何合适的酶切位置（因为promoter 和poly-A tail 外
: 围的酶切位置本来就不多，就算有也很可能正好在我们的fusion protein 上同时也有
: 切点，另外还要看是否和piggybac里面的克隆位置compatible，实在是不看好。
: 我更感兴趣的是：如果我的质粒不在那个piggay vector 上，光是表达helper
: transposase，
: 能否增进我的那个质粒的随机插入几率？
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l*******i
发帖数: 153 | 57 我们实验室就是做转座子。piggybac转座效率还可以，但是像viral vector一样,对
trangene的大小敏感，超过7Kb，转座效率（转座子整合进基因组的效率）就会急剧下
降。
不建议把转座子和转座酶（helper）克隆在一个质粒上，这样会导致质粒太大而降低转
染效率。
另外，转座子和转座酶的比例不是在1:1时，转座效率最高。对多数人和小鼠的细胞来
说，转座子和转座酶比例在5:1 - 10:1时，转座效率最高。 |
r****r
发帖数: 36 | 58 how do you transfect 17K plasmids? we use lipofectamin 2000 or TransIT LT1
here. |
