c****d
发帖数: 501 | 1 测序以后发现一个点突变
如果不想重新做构建的话
有什么办法可以correct it？
谢谢啦 |
k****l
发帖数: 279 | 2 Site-directed mutagenesis
or cut that piece out, PCR that piece from a right plasmid,do a ligation
【在 c****d 的大作中提到】
: 测序以后发现一个点突变
: 如果不想重新做构建的话
: 有什么办法可以correct it？
: 谢谢啦
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N2
发帖数: 81 | 3 1)screen 3-5 more colonies and verify the sequence of that site by
sequencing.
2)if there is no correct one, it seems the fragment used for ligation having
that mutation.
3) do a reverse PCR to fix it if you plasmid is not too big.
4)site mutegensis by Quick Change
5)rebuild the plasmid with new fragments from PCR using Phusion DNA
ploymerase
from 3) to 5) find any one which will be easy for you.
good luck!
【在 c****d 的大作中提到】
: 测序以后发现一个点突变
: 如果不想重新做构建的话
: 有什么办法可以correct it？
: 谢谢啦
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c****d
发帖数: 501 | 4 谢谢了
不过第二点 是不是和我重新做这个质粒差不多麻烦了
【在 k****l 的大作中提到】
: Site-directed mutagenesis
: or cut that piece out, PCR that piece from a right plasmid,do a ligation
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c****d
发帖数: 501 | 5 多谢！
刚刚送了剩下的几个clone去测序 但愿有个好的
但是原始的template应该没问题 那个质粒是测过序的
somehow应该就是pcr过程中mutate了
我分子生物学做的不是很多 不知道reverse PCR是咋个意思
这个plasmid有10k以上 算是大的吗？
site mutegenesis 一般自己能做吗 还是送出去公司做呢
having
【在 N2 的大作中提到】
: 1)screen 3-5 more colonies and verify the sequence of that site by
: sequencing.
: 2)if there is no correct one, it seems the fragment used for ligation having
: that mutation.
: 3) do a reverse PCR to fix it if you plasmid is not too big.
: 4)site mutegensis by Quick Change
: 5)rebuild the plasmid with new fragments from PCR using Phusion DNA
: ploymerase
: from 3) to 5) find any one which will be easy for you.
: good luck!
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b******s
发帖数: 1089 | 6 做cloning，我觉得要是有问题，干脆重做。要是只是插入片段上有突变，重新扩增，
酶切，ligation也不算麻烦。一时偷懒，下面的步骤可能麻烦会更多，经常到最后还要
重新来过。
【在 c****d 的大作中提到】
: 谢谢了
: 不过第二点 是不是和我重新做这个质粒差不多麻烦了
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l******g
发帖数: 1145 | 7 克隆牛人教我的是：如果pcr的片段比较大(突变几率比较高的话），那么一开始就set
up几个pcr，然后独立做克隆，一起送去测序，然后有突变的话，运气好的时候另一个
pcr出来的片段那那一块没突变，那么可以切下来subcloning过去替换。
一开始设几个独立的pcr，是为了防止pcr刚开始几个cycle就出现mutation，那么出来
的产物就几乎全部有mutation。
如果片段不大的话，重新来过啦～ |
g*********5
发帖数: 2533 | 8 来米国后发现不会作克隆了。。。
以前国内没有克隆不出来的载体
现在怎么也作不好。
大家讨论下，关键技术点是什么？ |
r*******y
发帖数: 48 | 9 easiest way is to do site mutagenesis to get it back to the correct one. |
c****d
发帖数: 501 | 10 我觉得这个很有道理啊
比如我现在的多个clone 是一个pcr出来的
结果测序回来 没有一个好的
但是mutation有同一位置的 也有不同位置的
我这个可能就是因为片段太大了
set
【在 l******g 的大作中提到】
: 克隆牛人教我的是：如果pcr的片段比较大(突变几率比较高的话），那么一开始就set
: up几个pcr，然后独立做克隆，一起送去测序，然后有突变的话，运气好的时候另一个
: pcr出来的片段那那一块没突变，那么可以切下来subcloning过去替换。
: 一开始设几个独立的pcr，是为了防止pcr刚开始几个cycle就出现mutation，那么出来
: 的产物就几乎全部有mutation。
: 如果片段不大的话，重新来过啦～
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c****d
发帖数: 501 | 11 是这样
从质粒1里边扩增片段A
从质粒2里边扩增片段B
然后把A和B连起来 再接到vector里边
其中片段A还比较大
现在就一个mutation 所以我想如果有简单办法correct的话
就不用重新来一遍了
【在 b******s 的大作中提到】
: 做cloning，我觉得要是有问题，干脆重做。要是只是插入片段上有突变，重新扩增，
: 酶切，ligation也不算麻烦。一时偷懒，下面的步骤可能麻烦会更多，经常到最后还要
: 重新来过。
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l******g
发帖数: 1145 | 12 这个mutation的上下游有酶切位点吗？如果有的话，从原来质粒里直接切了替换过去。
site mutagenesis也是个办法，但毕竟也是pcr，不排除mutation的可能，而且连
vector的部分也要sequence。
【在 c****d 的大作中提到】
: 是这样
: 从质粒1里边扩增片段A
: 从质粒2里边扩增片段B
: 然后把A和B连起来 再接到vector里边
: 其中片段A还比较大
: 现在就一个mutation 所以我想如果有简单办法correct的话
: 就不用重新来一遍了
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w******2
发帖数: 64 | 13 直接在突变位点设计引物overlapping. 用保真酶pcr, DapI 消化PCR产物， 转化， 挑
克隆测序。
【在 c****d 的大作中提到】
: 测序以后发现一个点突变
: 如果不想重新做构建的话
: 有什么办法可以correct it？
: 谢谢啦
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