m******5
发帖数: 1383 | 1 如图，有一个BAC transgenic Vector含有一个要命的FRT flanked Neo cassette
必须用flipase切除
为省时间，想co-microinject一个CAGGS-Flpe plasmid
没有查到相关文献，但觉理论上可行，求高手re-assurance!! |
m******5
发帖数: 1383 | 2 顶！！！！
【在 m******5 的大作中提到】
: 如图，有一个BAC transgenic Vector含有一个要命的FRT flanked Neo cassette
: 必须用flipase切除
: 为省时间，想co-microinject一个CAGGS-Flpe plasmid
: 没有查到相关文献，但觉理论上可行，求高手re-assurance!!
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s****a
发帖数: 55 | 3 co-microinject两个DNA没问题。但是你得要提多少BAC呀。你的 BAC大提能有多少DNA
？ |
m******5
发帖数: 1383 | 4 why do you think concentration is a problem?
【在 s****a 的大作中提到】
: co-microinject两个DNA没问题。但是你得要提多少BAC呀。你的 BAC大提能有多少DNA
: ？
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s****a
发帖数: 55 | 5 你要inject到哪里？BAC量和质粒比起来怎么样？ |
m******5
发帖数: 1383 | 6 pronuclear injection 做transgenic line
approximately 1:1
1ng/ul in injection buffer
【在 s****a 的大作中提到】
: 你要inject到哪里？BAC量和质粒比起来怎么样？
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s****a
发帖数: 55 | 7 BAC的copy数量要少很多。 还有flipase的效率应该比cre要低一些。你后面还得做
screening 把没有切掉的克隆去掉。
不知道flipase可不可以做in vitro的剪切。如果可以的话剪了重新转化，再大提做
injection也不是很多活啊。 |
m******5
发帖数: 1383 | 8 invitro拓扑结构不会出问题么？倒是有这个菌但我手上没有
【在 s****a 的大作中提到】
: BAC的copy数量要少很多。 还有flipase的效率应该比cre要低一些。你后面还得做
: screening 把没有切掉的克隆去掉。
: 不知道flipase可不可以做in vitro的剪切。如果可以的话剪了重新转化，再大提做
: injection也不是很多活啊。
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m******5
发帖数: 1383 | 9 非常感谢！包子送上先，另外您是做哪个方向的？
【在 s****a 的大作中提到】
: BAC的copy数量要少很多。 还有flipase的效率应该比cre要低一些。你后面还得做
: screening 把没有切掉的克隆去掉。
: 不知道flipase可不可以做in vitro的剪切。如果可以的话剪了重新转化，再大提做
: injection也不是很多活啊。
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m******5
发帖数: 1383 | 10 另外，你在这里说的克隆是说positive transgenic founder么？
【在 s****a 的大作中提到】
: BAC的copy数量要少很多。 还有flipase的效率应该比cre要低一些。你后面还得做
: screening 把没有切掉的克隆去掉。
: 不知道flipase可不可以做in vitro的剪切。如果可以的话剪了重新转化，再大提做
: injection也不是很多活啊。
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s****a
发帖数: 55 | 11 就是这个POSTIVE FOUNDER.
我做Neuroscience的。你说的这块其实我不是很了解。我记得cre好像可以在in vitro
的情况下使用. flipase不知道行不行吧。
另外，我想过把一个bac整合到细胞基因组里，做一个stable line。 不知道lz有没有
什么好的建议。能比较快，而且很稳定。 谢谢！ |
s****a
发帖数: 55 | 12 就是这个POSTIVE FOUNDER.
我做Neuroscience的。你说的这块其实我不是很了解。我记得cre好像可以在in vitro
的情况下使用. flipase不知道行不行吧。
另外，我想过把一个bac整合到细胞基因组里，做一个stable line。 不知道lz有没有
什么好的建议。能比较快，而且很稳定。 谢谢！ |
m******5
发帖数: 1383 | 13 参考这篇文章的supplemental method
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2871289/
vitro
【在 s****a 的大作中提到】
: 就是这个POSTIVE FOUNDER.
: 我做Neuroscience的。你说的这块其实我不是很了解。我记得cre好像可以在in vitro
: 的情况下使用. flipase不知道行不行吧。
: 另外，我想过把一个bac整合到细胞基因组里，做一个stable line。 不知道lz有没有
: 什么好的建议。能比较快，而且很稳定。 谢谢！
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m******5
发帖数: 1383 | 14 I did it anyway, waiting for results……………………
vitro
【在 s****a 的大作中提到】
: 就是这个POSTIVE FOUNDER.
: 我做Neuroscience的。你说的这块其实我不是很了解。我记得cre好像可以在in vitro
: 的情况下使用. flipase不知道行不行吧。
: 另外，我想过把一个bac整合到细胞基因组里，做一个stable line。 不知道lz有没有
: 什么好的建议。能比较快，而且很稳定。 谢谢！
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s****a
发帖数: 55 | 15 thanks a lot!
good luck! |
m******5
发帖数: 1383 | 16 Glad that I could provide some information useful to you. I am keeping
sucking in those informations, if you are interested, I would be very happy
to discuses with you!
【在 s****a 的大作中提到】
: thanks a lot!
: good luck!
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s****a
发帖数: 55 | 17 that will be great! I will PS you my contact info. i was thinking you can
just transform flipase into the bacteria with your BAC and do PCR screening.
that should work. talk to you later. |
