r*m
发帖数: 16380 | |
s******s
发帖数: 13035 | 2 这玩意儿，要是你们实验室老是同时研究那么几十个基因，应该还行。
【在 r*m 的大作中提到】
: 想看看这个技术有多普及，谢谢。
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l******u
发帖数: 936 | 3 这个是研究转录最精确的机器了，直接digital read RNA，
比什么 qPCR， microarray，RNA seq 都准确。
缺点是通量不是很大，一次只能看几百几个gene。
【在 r*m 的大作中提到】
: 想看看这个技术有多普及，谢谢。
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l********e
发帖数: 415 | 4 不也是hybridization based,
为什么比microarray, qPCR, RNA seq都精确？
【在 l******u 的大作中提到】
: 这个是研究转录最精确的机器了，直接digital read RNA，
: 比什么 qPCR， microarray，RNA seq 都准确。
: 缺点是通量不是很大，一次只能看几百几个gene。
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r*m
发帖数: 16380 | 5 信噪比胜过microarray超过一个数量级。
灵敏度超过microarray， RNA-seq大于一个数量级。
没有扩增反应，定量更准确。
【在 l********e 的大作中提到】
: 不也是hybridization based,
: 为什么比microarray, qPCR, RNA seq都精确？
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l********e
发帖数: 415 | 6 求出处
【在 r*m 的大作中提到】
: 信噪比胜过microarray超过一个数量级。
: 灵敏度超过microarray， RNA-seq大于一个数量级。
: 没有扩增反应，定量更准确。
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r*m
发帖数: 16380 | 7 rt
【在 l********e 的大作中提到】
: 求出处
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l********e
发帖数: 415 | 8 谢了
两个问题
1) 这东西 没有设备的实验室想做的话 要怎么做？
2）和RNA-seq的比较好象文章里没看到(2008的文章 看到也要打个折扣 ...）是你们自
己比的么
【在 r*m 的大作中提到】
: rt
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r*m
发帖数: 16380 | 9 1.找人合作
2.跟RNA-seq适用范围不同。nanoString适合测几百个已知的基因。 |
l******u
发帖数: 936 | 10 直接用tag去read RNA的序列， 没有RT这一步，而RT的酶反应这一步要失去很多有用的
转录的信息。
其他研究转录的工具基本都要RT。
【在 l********e 的大作中提到】
: 不也是hybridization based,
: 为什么比microarray, qPCR, RNA seq都精确？
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q******g
发帖数: 3858 | |
D*a
发帖数: 6830 | 12 搭车问，这玩意搞RNA很普及了么？几百个已知基因，听起来正是我们需要的啊。 |
l******u
发帖数: 936 | 13 不普及，因为挺贵。欧洲好象不是很多。
【在 D*a 的大作中提到】
: 搭车问，这玩意搞RNA很普及了么？几百个已知基因，听起来正是我们需要的啊。
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D*a
发帖数: 6830 | 14 那做出来的数据被广泛认可么？
【在 l******u 的大作中提到】
: 不普及，因为挺贵。欧洲好象不是很多。
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l******u
发帖数: 936 | 15 yes.
please check Peter Mombaerts's Cell paper
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22078886
【在 D*a 的大作中提到】
: 那做出来的数据被广泛认可么？
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D*a
发帖数: 6830 | 16 thanks!
【在 l******u 的大作中提到】
: yes.
: please check Peter Mombaerts's Cell paper
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22078886
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r*m
发帖数: 16380 | 17 我有一台，只有我一个人在玩，一星期也用不了一次，浪费啊。
欢迎合作。 |
D*a
发帖数: 6830 | 18 那你稍微科普科普呗，还能搞几个包子什么的。
比如样品制备仪器使用数据分析后期confirm啥的
-- 一个懒得看文献的id（LOL）
【在 r*m 的大作中提到】
: 我有一台，只有我一个人在玩，一星期也用不了一次，浪费啊。
: 欢迎合作。
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r*m
发帖数: 16380 | 19 样品制备最简单了， 就是total RNA，质量差点也没关系。
出来的data更简单，就是每个RNA的数量，比如ACT1 8888个，BRC1 1888个，全列在
excel表里面，直观比较就行。 |
l***s
发帖数: 841 | 20 I did some comparative analysis using our own qPCR, RNA-seq, and nanostring
data. Looks like qPCR is still the best. Of course, it is a challenge to
analyze several hundred genes using qPCR. Typically, we still need to
validate nanostring data using an independent approach such as qPCR.
【在 l********e 的大作中提到】
: 谢了
: 两个问题
: 1) 这东西 没有设备的实验室想做的话 要怎么做？
: 2）和RNA-seq的比较好象文章里没看到(2008的文章 看到也要打个折扣 ...）是你们自
: 己比的么
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u**********d
发帖数: 573 | 21 spt！
【在 D*a 的大作中提到】
: 那你稍微科普科普呗，还能搞几个包子什么的。
: 比如样品制备仪器使用数据分析后期confirm啥的
: -- 一个懒得看文献的id（LOL）
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r*m
发帖数: 16380 | 22 我觉得QPCR不比nanoString更准确啊。
普通QPCR理论上只能测2倍以上的变化。因为PCR这个过程的误差就是两倍（一个cycle
）。
nanoString没有这个放大信号的过程。
nanostring
【在 l***s 的大作中提到】
: I did some comparative analysis using our own qPCR, RNA-seq, and nanostring
: data. Looks like qPCR is still the best. Of course, it is a challenge to
: analyze several hundred genes using qPCR. Typically, we still need to
: validate nanostring data using an independent approach such as qPCR.
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O******e
发帖数: 4845 | 23 前一阵子我们考虑过这个系统，最后还是觉得局限性太多，不如直接上RNA-Seq。而且
这系统很贵，买后你基本就被这个公司签了卖身契，因为如果你需要一个新的probe
library，只能花钱让他们来做。自主性太差。
【在 D*a 的大作中提到】
: thanks!
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l***s
发帖数: 841 | 24 We often use qPCR to detect 30% change (with duplicated reactions). qPCR is
most sensitive because of the signal ampplification process. We sometimes
use qPCR for about 100 cells with good sensitivity.
cycle
【在 r*m 的大作中提到】
: 我觉得QPCR不比nanoString更准确啊。
: 普通QPCR理论上只能测2倍以上的变化。因为PCR这个过程的误差就是两倍（一个cycle
: ）。
: nanoString没有这个放大信号的过程。
:
: nanostring
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r*m
发帖数: 16380 | 25 QPCR是可以给出30%差距这样的“数据”，但是理论上这是“错误”的。因为PCR反应前
几步理论上可以差一个cycle，也就是2倍的差距。
这不是我自己想出来的，是设计QPCR的公司反复测试的结论。
所以普通QPCR只能报告2倍以上的差距（可靠），2倍以下都是不可靠的。
is
【在 l***s 的大作中提到】
: We often use qPCR to detect 30% change (with duplicated reactions). qPCR is
: most sensitive because of the signal ampplification process. We sometimes
: use qPCR for about 100 cells with good sensitivity.
:
: cycle
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k****n
发帖数: 158 | 26 second this
is
【在 l***s 的大作中提到】
: We often use qPCR to detect 30% change (with duplicated reactions). qPCR is
: most sensitive because of the signal ampplification process. We sometimes
: use qPCR for about 100 cells with good sensitivity.
:
: cycle
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D*a
发帖数: 6830 | 27 请问能不能给个链接啥的？
【在 r*m 的大作中提到】
: QPCR是可以给出30%差距这样的“数据”，但是理论上这是“错误”的。因为PCR反应前
: 几步理论上可以差一个cycle，也就是2倍的差距。
: 这不是我自己想出来的，是设计QPCR的公司反复测试的结论。
: 所以普通QPCR只能报告2倍以上的差距（可靠），2倍以下都是不可靠的。
:
: is
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D*a
发帖数: 6830 | 28 我理解RNA-Seq是全RNA吧？就是用那个poly A尾巴还是什么来钓。这个nanoString是得
先搞一个库，完了之后多一个也不能弄？
但是是不是说如果每个RNA都搞一搞，是不是P值修正的就更严格啊，如果只有几百个基
因，那么更容易达到显著性一些？
【在 O******e 的大作中提到】
: 前一阵子我们考虑过这个系统，最后还是觉得局限性太多，不如直接上RNA-Seq。而且
: 这系统很贵，买后你基本就被这个公司签了卖身契，因为如果你需要一个新的probe
: library，只能花钱让他们来做。自主性太差。
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r*m
发帖数: 16380 | 29 我们刚买了biorad的QPCR系统，培训的时候专门讨论了这个。
还有更高级的QPCR（不太普及），可以精确到10%这个范围。
用普通QPCR定量到20-30%，某种意义上是欺负reviewer也不懂。
【在 D*a 的大作中提到】
: 请问能不能给个链接啥的？
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r*m
发帖数: 16380 | 30 还有sensitivity跟accuracy是不一样的。
QPCR有放大步骤，所以更sensitive也不奇怪，但正因为有这个放大步骤，所以精确度
是下降了。无法保证所有分子被平等地放大。 |
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l***s
发帖数: 841 | 31 What you said is true for absolute quantification. However, most people are
only interested in relative quantification focusing on expression changes (
in percentage term). In this case, a reference RNA sample is included for
comparison, and the "anomaly" from the first few cycles should have been
cancelled out. In our experience, replicated reactions should always have <0
.2 cycle difference. And a >0.4 (30% change) cycle change can be reliably
detected.
【在 r*m 的大作中提到】
: QPCR是可以给出30%差距这样的“数据”，但是理论上这是“错误”的。因为PCR反应前
: 几步理论上可以差一个cycle，也就是2倍的差距。
: 这不是我自己想出来的，是设计QPCR的公司反复测试的结论。
: 所以普通QPCR只能报告2倍以上的差距（可靠），2倍以下都是不可靠的。
:
: is
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l***s
发帖数: 841 | 32 But any detection system would have the same issue. For example, you can
never say that all RNA molecules are hybridized with the same sensitivity
and specificity using nannostring probes. Actually, qPCR is considered more
unbiased compared to probe hybridization.
【在 r*m 的大作中提到】
: 还有sensitivity跟accuracy是不一样的。
: QPCR有放大步骤，所以更sensitive也不奇怪，但正因为有这个放大步骤，所以精确度
: 是下降了。无法保证所有分子被平等地放大。
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r*m
发帖数: 16380 | 33 这是为什么呢？
QPCR用两个primers， 各20-25bp，nanoString也是两个probe， 各50bp，而且没有
amplification，至少从表面上看不出来QPCR更准确啊。
more
【在 l***s 的大作中提到】
: But any detection system would have the same issue. For example, you can
: never say that all RNA molecules are hybridized with the same sensitivity
: and specificity using nannostring probes. Actually, qPCR is considered more
: unbiased compared to probe hybridization.
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O******e
发帖数: 4845 | 34 你这是针对一个反应。30%的变化如果可以重复，一样可靠。要综合考虑问题。
【在 r*m 的大作中提到】
: QPCR是可以给出30%差距这样的“数据”，但是理论上这是“错误”的。因为PCR反应前
: 几步理论上可以差一个cycle，也就是2倍的差距。
: 这不是我自己想出来的，是设计QPCR的公司反复测试的结论。
: 所以普通QPCR只能报告2倍以上的差距（可靠），2倍以下都是不可靠的。
:
: is
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O******e
发帖数: 4845 | 35 如果你就是想测那几百个基因的表达变化，这个还是不错。但很多时候你根本不知道
变化的是哪些基因，总不能拿十几个库挨个看吧。太费钱费功夫。
不过又一想，是不是可以跟microarray一块用：先microarray知道个大致范围，然后
nanostring去看具体的变化。
我也没用过nanostring，说不定理解有误。
【在 D*a 的大作中提到】
: 我理解RNA-Seq是全RNA吧？就是用那个poly A尾巴还是什么来钓。这个nanoString是得
: 先搞一个库，完了之后多一个也不能弄？
: 但是是不是说如果每个RNA都搞一搞，是不是P值修正的就更严格啊，如果只有几百个基
: 因，那么更容易达到显著性一些？
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s******s
发帖数: 13035 | 36 几百个据说是吹牛，据说他们自己的rep也说不要一次做这么多。
不过我估计100个应该可以。
【在 O******e 的大作中提到】
: 如果你就是想测那几百个基因的表达变化，这个还是不错。但很多时候你根本不知道
: 变化的是哪些基因，总不能拿十几个库挨个看吧。太费钱费功夫。
: 不过又一想，是不是可以跟microarray一块用：先microarray知道个大致范围，然后
: nanostring去看具体的变化。
: 我也没用过nanostring，说不定理解有误。
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r*m
发帖数: 16380 | 37 我做过300个基因的probeset，没有问题，很好很强大。
【在 s******s 的大作中提到】
: 几百个据说是吹牛，据说他们自己的rep也说不要一次做这么多。
: 不过我估计100个应该可以。
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r*m
发帖数: 16380 | 38 这个基本是正解。
nanoString要事先知道大致范围，想看哪些pathway， response等等。可以是从
microarray来的，也可是以前paper里面来的。
在四五十到四五百基因这个范围内， nanoString很有用。
【在 O******e 的大作中提到】
: 如果你就是想测那几百个基因的表达变化，这个还是不错。但很多时候你根本不知道
: 变化的是哪些基因，总不能拿十几个库挨个看吧。太费钱费功夫。
: 不过又一想，是不是可以跟microarray一块用：先microarray知道个大致范围，然后
: nanostring去看具体的变化。
: 我也没用过nanostring，说不定理解有误。
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s******s
发帖数: 13035 | 39 ok. 有人做过就行。
记得有篇用这个screen ChIP-seq antibody的paper, 我觉得就是很好的应用。
有一些locus一直要反复看，虽然第一次成本很高，但是滩平了很便宜快速
【在 r*m 的大作中提到】
: 我做过300个基因的probeset，没有问题，很好很强大。
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l********e
发帖数: 415 | 40 This is helpful, Thanks a lot!!
nanostring
【在 l***s 的大作中提到】
: I did some comparative analysis using our own qPCR, RNA-seq, and nanostring
: data. Looks like qPCR is still the best. Of course, it is a challenge to
: analyze several hundred genes using qPCR. Typically, we still need to
: validate nanostring data using an independent approach such as qPCR.
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q******g
发帖数: 3858 | 41 nanostring的结果需要qPCR来验证吗？
【在 r*m 的大作中提到】
: 这个基本是正解。
: nanoString要事先知道大致范围，想看哪些pathway， response等等。可以是从
: microarray来的，也可是以前paper里面来的。
: 在四五十到四五百基因这个范围内， nanoString很有用。
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s******s
发帖数: 13035 | 42 理论上不需要啊。实际上新技术出来，无聊reviewer都需要老技术
对照一下。这个普及以后就没问题了
【在 q******g 的大作中提到】
: nanostring的结果需要qPCR来验证吗？
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r*m
发帖数: 16380 | 43 对，因为是新技术，所以我一般挑3-4个主要基因出来用QPCR验证一下。
等大家接受了就没必要了。
【在 s******s 的大作中提到】
: 理论上不需要啊。实际上新技术出来，无聊reviewer都需要老技术
: 对照一下。这个普及以后就没问题了
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