b******i
发帖数: 287 | 1 憋了三天终于能发文了。
小女子不才，试图做3'RACE，1个月了还是没有结果。
详情如下：
CDS全长2K多一右，想知道转录起始和终止位点，于是做5/3RACE，5'RACE很容易就做出
来了，3'RACE就怎么都没有结果，3'端很多AT，尝试了降低延伸温度到60－65度，还是
没有结果，不知道如何是好，求指点！ |
C*******e
发帖数: 4348 | 2 试试RLM-RACE？
就是RNA ligase mediated RACE
文献搜索一下
【在 b******i 的大作中提到】
: 憋了三天终于能发文了。
: 小女子不才，试图做3'RACE，1个月了还是没有结果。
: 详情如下：
: CDS全长2K多一右，想知道转录起始和终止位点，于是做5/3RACE，5'RACE很容易就做出
: 来了，3'RACE就怎么都没有结果，3'端很多AT，尝试了降低延伸温度到60－65度，还是
: 没有结果，不知道如何是好，求指点！
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b******i
发帖数: 287 | 3 谢谢回复啊！刚刚等了半天没人回复心里哇凉哇凉的。
看了一下RLM-RACE KIT的PROTOCAL，它好像并没有对3'RACE做出什么改进噢。貌似是针
对获得5'端序列的，或者针对扩增全长CDS的。而且大家貌似普片都认为3'RACE比5'
RACE简单容易，为啥我就做不出来呢。。。。
一直在用Roche的5/3RACE kit，也试过用GC RICH KIT （老板说AT RICH的SEQUENCE也
可以用GC RICH KIT，但是我没有做出来）。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 试试RLM-RACE？
: 就是RNA ligase mediated RACE
: 文献搜索一下
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C*******e
发帖数: 4348 | 4 我以前做的3'RLM-RACE
直接PCR产物放在pTOPO-blunt-II里面去测序的
没有用什么kit
5'倒是用的传统的primer extension
【在 b******i 的大作中提到】
: 谢谢回复啊！刚刚等了半天没人回复心里哇凉哇凉的。
: 看了一下RLM-RACE KIT的PROTOCAL，它好像并没有对3'RACE做出什么改进噢。貌似是针
: 对获得5'端序列的，或者针对扩增全长CDS的。而且大家貌似普片都认为3'RACE比5'
: RACE简单容易，为啥我就做不出来呢。。。。
: 一直在用Roche的5/3RACE kit，也试过用GC RICH KIT （老板说AT RICH的SEQUENCE也
: 可以用GC RICH KIT，但是我没有做出来）。
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b******i
发帖数: 287 | 5 我现在，是P不出带来。。。。。。 555
P完一次，然后Nest PCR再P，也是没有带。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我以前做的3'RLM-RACE
: 直接PCR产物放在pTOPO-blunt-II里面去测序的
: 没有用什么kit
: 5'倒是用的传统的primer extension
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b******i
发帖数: 287 | 6 不知道，是不是因为序列的所形成的结构太复杂，没有办法打开？有什么办法解决呢？
试过低温延伸，也试过用GC RICH KIT去做，都不成功。之前做其他基因的时候，很容
易就做出3RACE的了，严重受挫啊～ :( |
C*******e
发帖数: 4348 | 7 看了一下，那个kit里面还是用的dT-anchor primer来做cDNA synthesis的
很大程度上这一步的效率取决于这个VTTTT-anchor primer跟poly-A tail的结合程度
我个人觉得既然你现在做不出来
很有可能是cDNA synthesis这一步就已经效率很低
我当时做RLM-3’RACE的一个原因就是原核没有poly-A tail
没有办法用poly-T的primer来做cDNA synthesis这一步
RLM-3'RACE带来的好处是
mRMA3'连上adaptor以后
后面的cDNA synthesis用的是adaptor specific oligomer
这个效率会有不同
如果已经山穷水尽，这个结果又一定要做出来
可以试试这个RLM-RACE的方法
不过就是多设计个引物，买点T4 RNA ligase而已
Roche的反转录酶还是不错的
～～～～～～～～～～～～～～～～～
另外如果你担心是因为mRNA的二级结构有影响的话
在把RNA加入cDNA synthsis反应之前
可以95度加热RNA3分钟，然后立刻放在冰上，冷却以后再用
【在 b******i 的大作中提到】
: 不知道，是不是因为序列的所形成的结构太复杂，没有办法打开？有什么办法解决呢？
: 试过低温延伸，也试过用GC RICH KIT去做，都不成功。之前做其他基因的时候，很容
: 易就做出3RACE的了，严重受挫啊～ :(
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b******i
发帖数: 287 | 8 真是个大好人啊给了这么详细的回复！！！
我觉得能排除cDNA的质量问题，是因为我用同一批的cDNA去做PCR是可以PCR到从ATG到
下游的1.7K片段（其实还没有拿到全长，做出了5RACE，知道了转录起始位点，而CDS全
长2.5K，我设计了很多引物，目前只能拿到1.7K的序列，后面的800bp 怎么尝试都P不
出来，而3'RACE目前也还在努力中），所以我觉得OLIGO DT引物反转录出来的cDNA应该
没有问题吧，5'端ATG部分的序列都有了，那肯定是从3'端走过来的拉，应该走通了啊
。。。。。。 可是为啥就P不出来呢？
或者我应该尝试一下你说的这个RLM KIT，提高cDNA的质量试试！
非常感谢你花时间帮忙解决我的问题！
【在 C*******e 的大作中提到】
: 看了一下，那个kit里面还是用的dT-anchor primer来做cDNA synthesis的
: 很大程度上这一步的效率取决于这个VTTTT-anchor primer跟poly-A tail的结合程度
: 我个人觉得既然你现在做不出来
: 很有可能是cDNA synthesis这一步就已经效率很低
: 我当时做RLM-3’RACE的一个原因就是原核没有poly-A tail
: 没有办法用poly-T的primer来做cDNA synthesis这一步
: RLM-3'RACE带来的好处是
: mRMA3'连上adaptor以后
: 后面的cDNA synthesis用的是adaptor specific oligomer
: 这个效率会有不同
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 我的意思是说你用VTTTT-adaptor去合成cDNA的时候
真正跟mRNA配对的只有VTTTT而已
如果先做一步mRNA-DNA adaptor的连接工作
后面用adaptor specific primer合成cDNA的时候配对的可以是你设计多长就多长
当然具体到实验这个会不会有帮助
谁也没办法预测
【在 b******i 的大作中提到】
: 真是个大好人啊给了这么详细的回复！！！
: 我觉得能排除cDNA的质量问题，是因为我用同一批的cDNA去做PCR是可以PCR到从ATG到
: 下游的1.7K片段（其实还没有拿到全长，做出了5RACE，知道了转录起始位点，而CDS全
: 长2.5K，我设计了很多引物，目前只能拿到1.7K的序列，后面的800bp 怎么尝试都P不
: 出来，而3'RACE目前也还在努力中），所以我觉得OLIGO DT引物反转录出来的cDNA应该
: 没有问题吧，5'端ATG部分的序列都有了，那肯定是从3'端走过来的拉，应该走通了啊
: 。。。。。。 可是为啥就P不出来呢？
: 或者我应该尝试一下你说的这个RLM KIT，提高cDNA的质量试试！
: 非常感谢你花时间帮忙解决我的问题！
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b******i
发帖数: 287 | 10 谢谢！等这个周末再试试，无果就去买这个RLM-RACE KIT，貌似还不算太贵。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我的意思是说你用VTTTT-adaptor去合成cDNA的时候
: 真正跟mRNA配对的只有VTTTT而已
: 如果先做一步mRNA-DNA adaptor的连接工作
: 后面用adaptor specific primer合成cDNA的时候配对的可以是你设计多长就多长
: 当然具体到实验这个会不会有帮助
: 谁也没办法预测
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C*******e
发帖数: 4348 | 11 另外RLM-RACE不是个kit
不过也过了好几年了
不知道是不是现在有这样一个kit了
【在 b******i 的大作中提到】
: 真是个大好人啊给了这么详细的回复！！！
: 我觉得能排除cDNA的质量问题，是因为我用同一批的cDNA去做PCR是可以PCR到从ATG到
: 下游的1.7K片段（其实还没有拿到全长，做出了5RACE，知道了转录起始位点，而CDS全
: 长2.5K，我设计了很多引物，目前只能拿到1.7K的序列，后面的800bp 怎么尝试都P不
: 出来，而3'RACE目前也还在努力中），所以我觉得OLIGO DT引物反转录出来的cDNA应该
: 没有问题吧，5'端ATG部分的序列都有了，那肯定是从3'端走过来的拉，应该走通了啊
: 。。。。。。 可是为啥就P不出来呢？
: 或者我应该尝试一下你说的这个RLM KIT，提高cDNA的质量试试！
: 非常感谢你花时间帮忙解决我的问题！
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b******i
发帖数: 287 | 12 Invitrogen卖这个KIT，所以我才说不是太贵。。。。。。 希望好用拉！
https://products.invitrogen.com/ivgn/product/AM1700
【在 C*******e 的大作中提到】
: 另外RLM-RACE不是个kit
: 不过也过了好几年了
: 不知道是不是现在有这样一个kit了
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 如果你仔细看这个kit
会发现只有5'用了RLM
3’还是用的polyT oligomer
【在 b******i 的大作中提到】
: Invitrogen卖这个KIT，所以我才说不是太贵。。。。。。 希望好用拉！
: https://products.invitrogen.com/ivgn/product/AM1700
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b******i
发帖数: 287 | 14 啊啊啊啊。。。。。
那要怎么？没有KIT的话，分开买？？？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 如果你仔细看这个kit
: 会发现只有5'用了RLM
: 3’还是用的polyT oligomer
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C*******e
发帖数: 4348 | 15 不需要kit啊
你再好好读一读RLM-RACE的文献
你需要买的就是， oligomers
还有T4 RNA ligase而已
反转录酶、PCR用的kit你已经有了
【在 b******i 的大作中提到】
: 啊啊啊啊。。。。。
: 那要怎么？没有KIT的话，分开买？？？
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y****y
发帖数: 123 | |
b******i
发帖数: 287 | 17 Thanks very much! I will certainly read some reference!
【在 C*******e 的大作中提到】
: 不需要kit啊
: 你再好好读一读RLM-RACE的文献
: 你需要买的就是， oligomers
: 还有T4 RNA ligase而已
: 反转录酶、PCR用的kit你已经有了
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b******i
发帖数: 287 | 18 Thanks for the sugestion! But why? I don't understand and want a little
more info on it. I guess it only helps Gc rich, don't pai me if I am wrong.
【在 y****y 的大作中提到】
: PCR时候加点DMSO试试
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y****y
发帖数: 123 | 19 DMSO是打开template用的
据说AT没有GC效果那么好但是也可以用
我也只是听说没实际用过 |
b******i
发帖数: 287 | 20 好的！谢谢！那我先试试DMSO，不行的话就买上面提到的试剂。
【在 y****y 的大作中提到】
: DMSO是打开template用的
: 据说AT没有GC效果那么好但是也可以用
: 我也只是听说没实际用过
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Z******5
发帖数: 435 | 21 建议后面PCR多试几种不同公司，不同特点的酶。比如我当时就是用Takara的
Primerstar和GC Buffer的LA Taq。有时候，其中某些酶扩增很烂或者没有，而另一些
酶-Buffer就很好。 |
a********k
发帖数: 2273 | 22 我觉得clontech的最好，他的Adavantage 2不是一般的强大
当然，他家的RACE kit也很好
【在 Z******5 的大作中提到】
: 建议后面PCR多试几种不同公司，不同特点的酶。比如我当时就是用Takara的
: Primerstar和GC Buffer的LA Taq。有时候，其中某些酶扩增很烂或者没有，而另一些
: 酶-Buffer就很好。
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