c**i 发帖数: 265 | 1 我在做一个RNA tethering assay in HEK293T,ORF1-stop codon- aptamer -KOZAK
-ORF2.
理论上ORF2蛋白是不应该表达,由于在终止密码子之后。但实验表明ORF2蛋白有表达,
并且表达量和转染的质粒量成线性关系。请问大家有没有这样的经验?十分感谢。 |
j******n 发帖数: 941 | 2 当ORF1的start codon 附近序列不够强 而ORF2的start codon附近序列很适合翻译的时
候 根据leaky scanning理论 ORF2会有一定强度的翻译的
按你这个设计,你再ORF2前面刻意加了Kozak序列 客观条件具备 所以ORF2被翻译也不
奇怪呀 |
c**i 发帖数: 265 | 3 ORF1也有很强的kozak的,ORF1总长~1000bp。ORF2的ATG和ORF1不是In-frame的,应该
不存在readthrough的问题。感觉很纠结。
【在 j******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 当ORF1的start codon 附近序列不够强 而ORF2的start codon附近序列很适合翻译的时 : 候 根据leaky scanning理论 ORF2会有一定强度的翻译的 : 按你这个设计,你再ORF2前面刻意加了Kozak序列 客观条件具备 所以ORF2被翻译也不 : 奇怪呀
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s******y 发帖数: 28562 | 4 这个不一定需要是readthrough 啊,既然你的ORF2 前面放有kozak sequence,
ribosome initiation machinary很容易就直接跳到那里开始表达了
【在 c**i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : ORF1也有很强的kozak的,ORF1总长~1000bp。ORF2的ATG和ORF1不是In-frame的,应该 : 不存在readthrough的问题。感觉很纠结。
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c**i 发帖数: 265 | 5 这么说,ribosome是采用jump而不是scan的方式来寻找第一个kozak么?这样即使第一
个很强也可能被跳过。我的ORF1和2是相同的KOZAK的,ORF2是luciferase,
untranfected的RLU是~500,有质粒的大约是1000倍,~300,000。 感觉信号很强。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个不一定需要是readthrough 啊,既然你的ORF2 前面放有kozak sequence, : ribosome initiation machinary很容易就直接跳到那里开始表达了
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s******y 发帖数: 28562 | 6 咦?难道这个不是已经是公认的了么?
在我的理解中,在体内,Ribosome并不是真的要一直从5'-end结合上去然后一路扫描
过去,而是大小亚基在其他蛋白的帮助下在ribosome biding site 上直接装配,
然后再扫描。所以,在中间开始是非常常见的事情,IRES element 不就是用来干
这个的么?
【在 c**i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这么说,ribosome是采用jump而不是scan的方式来寻找第一个kozak么?这样即使第一 : 个很强也可能被跳过。我的ORF1和2是相同的KOZAK的,ORF2是luciferase, : untranfected的RLU是~500,有质粒的大约是1000倍,~300,000。 感觉信号很强。
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l******g 发帖数: 1623 | 7 CAP依赖的翻译机制好像scan到第一个intitiation site就开始翻译,并不会从中间的
initiation开始。原核细胞里面倒是可以从一个mRNA的几个initation site开始。
LZ的ORF1序列像不像IRES? 5'UTR到ORF2前面有没有不小心加的splicing site?
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 咦?难道这个不是已经是公认的了么? : 在我的理解中,在体内,Ribosome并不是真的要一直从5'-end结合上去然后一路扫描 : 过去,而是大小亚基在其他蛋白的帮助下在ribosome biding site 上直接装配, : 然后再扫描。所以,在中间开始是非常常见的事情,IRES element 不就是用来干 : 这个的么?
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s******y 发帖数: 28562 | 8 在我的理解中,5'-CAP structure 本质上就是一个strong ribosome assembling
signal 吧,然后装好了的ribosome 扫到第一个ATG就可以开始翻译了。
但是,很多RNA sequence, 尤其是Kozak sequence,也是可以启动ribosome
assembling的吧?楼主的第二个ORF 前面有Kozak sequence。
另外,即使是在CAP启动的翻译,如果两个ATG 距离得不远的话,我的记忆中
好像有时候也会跳过第一个ATG而在第二个开始。
【在 l******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : CAP依赖的翻译机制好像scan到第一个intitiation site就开始翻译,并不会从中间的 : initiation开始。原核细胞里面倒是可以从一个mRNA的几个initation site开始。 : LZ的ORF1序列像不像IRES? 5'UTR到ORF2前面有没有不小心加的splicing site?
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j******n 发帖数: 941 | 9 这个问题在真核生物中一直有争论 不过现在越来越多的证据显示一条mRNA仍然可能从
不同的起始密码子翻译出不同蛋白 去了解下ATF-4基因就知道了 楼主的情况完全在情
理之中 |
l******g 发帖数: 1623 | 10 看来我得买本新的分子生物学教科书来读读了,知识老化严重
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 咦?难道这个不是已经是公认的了么? : 在我的理解中,在体内,Ribosome并不是真的要一直从5'-end结合上去然后一路扫描 : 过去,而是大小亚基在其他蛋白的帮助下在ribosome biding site 上直接装配, : 然后再扫描。所以,在中间开始是非常常见的事情,IRES element 不就是用来干 : 这个的么?
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l******g 发帖数: 1623 | 11 看来工业界没一个明白人啊,我们作cell line的需要同时表达多个gene,都是用IRES
或者多个promoter转录出几个mRNA, 做出的质粒超级大。还没看到过用一个promoter几
个起始密码的设计。
【在 j******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个问题在真核生物中一直有争论 不过现在越来越多的证据显示一条mRNA仍然可能从 : 不同的起始密码子翻译出不同蛋白 去了解下ATF-4基因就知道了 楼主的情况完全在情 : 理之中
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c**i 发帖数: 265 | 12 感谢楼上诸位!
我一直以为cap-dependent的翻译是scan的在真核中,在没有特殊元件的情况下是不会
在中间起始翻译的。 原来jump,leaky scan和reinitiate都是会在一定程度发生的。
我换个weak kozak试试。谢谢大家。 |
s******y 发帖数: 28562 | 13 工业界只用已经搞明白的机理,那种不明不白的,万一做错了就有来自上级的麻烦了。
IRES
【在 l******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 看来工业界没一个明白人啊,我们作cell line的需要同时表达多个gene,都是用IRES : 或者多个promoter转录出几个mRNA, 做出的质粒超级大。还没看到过用一个promoter几 : 个起始密码的设计。
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l**********1 发帖数: 5204 | 14 RE: LZ
if weaker Kozak still got ORF2 expression
可能有TRE/Retrotransposon working.
pls refer:
Grabundzija I et al. (2010)
Comparative Analysis of Transposable Element Vector Systems in Human Cells
Mol Ther. 18: 1200–1209.
link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2889740/
or
one Finnish PhD thesis (2011)
its title:
'The Transcriptional Regulation of Retrotransposon BARE’
full text pdf file link:
https://helda.helsinki.fi/handle/10138/28135
【在 c**i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 感谢楼上诸位! : 我一直以为cap-dependent的翻译是scan的在真核中,在没有特殊元件的情况下是不会 : 在中间起始翻译的。 原来jump,leaky scan和reinitiate都是会在一定程度发生的。 : 我换个weak kozak试试。谢谢大家。
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