c**i
发帖数: 265 | 1 我在做一个RNA tethering assay in HEK293T，ORF1-stop codon- aptamer -KOZAK
-ORF2.
理论上ORF2蛋白是不应该表达，由于在终止密码子之后。但实验表明ORF2蛋白有表达，
并且表达量和转染的质粒量成线性关系。请问大家有没有这样的经验？十分感谢。 |
j******n
发帖数: 941 | 2 当ORF1的start codon 附近序列不够强 而ORF2的start codon附近序列很适合翻译的时
候 根据leaky scanning理论 ORF2会有一定强度的翻译的
按你这个设计，你再ORF2前面刻意加了Kozak序列 客观条件具备 所以ORF2被翻译也不
奇怪呀 |
c**i
发帖数: 265 | 3 ORF1也有很强的kozak的，ORF1总长~1000bp。ORF2的ATG和ORF1不是In-frame的，应该
不存在readthrough的问题。感觉很纠结。
【在 j******n 的大作中提到】
: 当ORF1的start codon 附近序列不够强 而ORF2的start codon附近序列很适合翻译的时
: 候 根据leaky scanning理论 ORF2会有一定强度的翻译的
: 按你这个设计，你再ORF2前面刻意加了Kozak序列 客观条件具备 所以ORF2被翻译也不
: 奇怪呀
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s******y
发帖数: 28562 | 4 这个不一定需要是readthrough 啊，既然你的ORF2 前面放有kozak sequence,
ribosome initiation machinary很容易就直接跳到那里开始表达了
【在 c**i 的大作中提到】
: ORF1也有很强的kozak的，ORF1总长~1000bp。ORF2的ATG和ORF1不是In-frame的，应该
: 不存在readthrough的问题。感觉很纠结。
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c**i
发帖数: 265 | 5 这么说，ribosome是采用jump而不是scan的方式来寻找第一个kozak么？这样即使第一
个很强也可能被跳过。我的ORF1和2是相同的KOZAK的，ORF2是luciferase，
untranfected的RLU是～500，有质粒的大约是1000倍，～300，000。 感觉信号很强。
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个不一定需要是readthrough 啊，既然你的ORF2 前面放有kozak sequence,
: ribosome initiation machinary很容易就直接跳到那里开始表达了
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s******y
发帖数: 28562 | 6 咦？难道这个不是已经是公认的了么？
在我的理解中，在体内，Ribosome并不是真的要一直从5'-end结合上去然后一路扫描
过去，而是大小亚基在其他蛋白的帮助下在ribosome biding site 上直接装配，
然后再扫描。所以，在中间开始是非常常见的事情，IRES element 不就是用来干
这个的么？
【在 c**i 的大作中提到】
: 这么说，ribosome是采用jump而不是scan的方式来寻找第一个kozak么？这样即使第一
: 个很强也可能被跳过。我的ORF1和2是相同的KOZAK的，ORF2是luciferase，
: untranfected的RLU是～500，有质粒的大约是1000倍，～300，000。 感觉信号很强。
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l******g
发帖数: 1623 | 7 CAP依赖的翻译机制好像scan到第一个intitiation site就开始翻译，并不会从中间的
initiation开始。原核细胞里面倒是可以从一个mRNA的几个initation site开始。
LZ的ORF1序列像不像IRES? 5'UTR到ORF2前面有没有不小心加的splicing site？
【在 s******y 的大作中提到】
: 咦？难道这个不是已经是公认的了么？
: 在我的理解中，在体内，Ribosome并不是真的要一直从5'-end结合上去然后一路扫描
: 过去，而是大小亚基在其他蛋白的帮助下在ribosome biding site 上直接装配，
: 然后再扫描。所以，在中间开始是非常常见的事情，IRES element 不就是用来干
: 这个的么？
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s******y
发帖数: 28562 | 8 在我的理解中，5'-CAP structure 本质上就是一个strong ribosome assembling
signal 吧，然后装好了的ribosome 扫到第一个ATG就可以开始翻译了。
但是，很多RNA sequence, 尤其是Kozak sequence，也是可以启动ribosome
assembling的吧？楼主的第二个ORF 前面有Kozak sequence。
另外，即使是在CAP启动的翻译，如果两个ATG 距离得不远的话，我的记忆中
好像有时候也会跳过第一个ATG而在第二个开始。
【在 l******g 的大作中提到】
: CAP依赖的翻译机制好像scan到第一个intitiation site就开始翻译，并不会从中间的
: initiation开始。原核细胞里面倒是可以从一个mRNA的几个initation site开始。
: LZ的ORF1序列像不像IRES? 5'UTR到ORF2前面有没有不小心加的splicing site？
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j******n
发帖数: 941 | 9 这个问题在真核生物中一直有争论 不过现在越来越多的证据显示一条mRNA仍然可能从
不同的起始密码子翻译出不同蛋白 去了解下ATF-4基因就知道了 楼主的情况完全在情
理之中 |
l******g
发帖数: 1623 | 10 看来我得买本新的分子生物学教科书来读读了，知识老化严重
【在 s******y 的大作中提到】
: 咦？难道这个不是已经是公认的了么？
: 在我的理解中，在体内，Ribosome并不是真的要一直从5'-end结合上去然后一路扫描
: 过去，而是大小亚基在其他蛋白的帮助下在ribosome biding site 上直接装配，
: 然后再扫描。所以，在中间开始是非常常见的事情，IRES element 不就是用来干
: 这个的么？
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l******g
发帖数: 1623 | 11 看来工业界没一个明白人啊，我们作cell line的需要同时表达多个gene，都是用IRES
或者多个promoter转录出几个mRNA, 做出的质粒超级大。还没看到过用一个promoter几
个起始密码的设计。
【在 j******n 的大作中提到】
: 这个问题在真核生物中一直有争论 不过现在越来越多的证据显示一条mRNA仍然可能从
: 不同的起始密码子翻译出不同蛋白 去了解下ATF-4基因就知道了 楼主的情况完全在情
: 理之中
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c**i
发帖数: 265 | 12 感谢楼上诸位！
我一直以为cap－dependent的翻译是scan的在真核中，在没有特殊元件的情况下是不会
在中间起始翻译的。 原来jump，leaky scan和reinitiate都是会在一定程度发生的。
我换个weak kozak试试。谢谢大家。 |
s******y
发帖数: 28562 | 13 工业界只用已经搞明白的机理，那种不明不白的，万一做错了就有来自上级的麻烦了。
IRES
【在 l******g 的大作中提到】
: 看来工业界没一个明白人啊，我们作cell line的需要同时表达多个gene，都是用IRES
: 或者多个promoter转录出几个mRNA, 做出的质粒超级大。还没看到过用一个promoter几
: 个起始密码的设计。
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 RE: LZ
if weaker Kozak still got ORF2 expression
可能有TRE/Retrotransposon working.
pls refer:
Grabundzija I et al. (2010)
Comparative Analysis of Transposable Element Vector Systems in Human Cells
Mol Ther. 18: 1200–1209.
link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2889740/
or
one Finnish PhD thesis (2011)
its title:
'The Transcriptional Regulation of Retrotransposon BARE’
full text pdf file link:
https://helda.helsinki.fi/handle/10138/28135
【在 c**i 的大作中提到】
: 感谢楼上诸位！
: 我一直以为cap－dependent的翻译是scan的在真核中，在没有特殊元件的情况下是不会
: 在中间起始翻译的。 原来jump，leaky scan和reinitiate都是会在一定程度发生的。
: 我换个weak kozak试试。谢谢大家。
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