l****j
发帖数: 70 | 1 我从细胞中分离纯化的ER和mitochondria，检测过marker蛋白没有相互contamination，
细胞转染过 HA-tag 的 ER protein，WB验证只在ER和MAM(mitochondria associated
ER membrane)存在，纯化的线粒体中没有发现此蛋白。
在whole cell lysate用 HA-agarose Immunoprecipitation,在同一张膜上
immunoblotting 两个 mitochondria inner membrane protein（mito protein 1，2）
竟然发现和mito protein 1 有 binding,
分别在不同细胞器中的蛋白质，有可能binding吗？ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 会不会是你把膜粉碎的时候把两种来源的膜都弄碎了然后弄到了一起？
ER 在mitochonrida 分裂的时期好像是有结合的。但是这个互相作用貌似
只对于线粒体外膜蛋白有效。
另外一个可能性就是你过表达的蛋白太多了，出现了aggregate or misfolding,
然后把本来应该sort 到线粒体里的蛋白给留住了。
contamination，
【在 l****j 的大作中提到】
: 我从细胞中分离纯化的ER和mitochondria，检测过marker蛋白没有相互contamination，
: 细胞转染过 HA-tag 的 ER protein，WB验证只在ER和MAM(mitochondria associated
: ER membrane)存在，纯化的线粒体中没有发现此蛋白。
: 在whole cell lysate用 HA-agarose Immunoprecipitation,在同一张膜上
: immunoblotting 两个 mitochondria inner membrane protein（mito protein 1，2）
: 竟然发现和mito protein 1 有 binding,
: 分别在不同细胞器中的蛋白质，有可能binding吗？
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i*****g
发帖数: 11893 | 3 artifact
这些事情很tricky的
我以前还发现一个 核蛋白和dicer相互作用
搜了半天，发现有篇文献还真这么描述，不过，一篇文献，显然太单薄了
最后不了了之
做mass spec，发现这些 new interactions， 实在是太多，
难的是如何编个故事making story |
k******0
发帖数: 1073 | 4 ER和线粒体是有相连的膜，所以即使ER蛋白质和线粒体内膜蛋白质共免疫沉降，也并不
奇怪，可能通过未鉴定的外膜蛋白连接的。同时跨内外膜的线粒体复合体已经鉴定的也
有。
如Sunnyday说的污染情况也很可能。你需要根据自己数据判断是否make sense。
WB有时很tricky，浓度过低或未优化时可能就测不出。所以你的蛋白质在纯化的线粒体
未检测出来，而IP后检测出来，也不是少见。
如果能否分离到足够量，跑胶做质谱分析可能会提供你更多的信息。
contamination，
【在 l****j 的大作中提到】
: 我从细胞中分离纯化的ER和mitochondria，检测过marker蛋白没有相互contamination，
: 细胞转染过 HA-tag 的 ER protein，WB验证只在ER和MAM(mitochondria associated
: ER membrane)存在，纯化的线粒体中没有发现此蛋白。
: 在whole cell lysate用 HA-agarose Immunoprecipitation,在同一张膜上
: immunoblotting 两个 mitochondria inner membrane protein（mito protein 1，2）
: 竟然发现和mito protein 1 有 binding,
: 分别在不同细胞器中的蛋白质，有可能binding吗？
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 LZ is doing Mitochondrial Ca(2+) apoptosis works now?
If Yes,
pls refer below figure which just cited from
Giorgi C et al. (2012)
Mitochondrial Ca(2+) and apoptosis.
Cell Calcium. 52: 36-43.
web link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22480931
more references:
Patergnani S et al. (2011)
Calcium signaling around Mitochondria Associated Membranes (MAMs).
Cell Commun Signal. 9:19.
link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21939514
【在 k******0 的大作中提到】
: ER和线粒体是有相连的膜，所以即使ER蛋白质和线粒体内膜蛋白质共免疫沉降，也并不
: 奇怪，可能通过未鉴定的外膜蛋白连接的。同时跨内外膜的线粒体复合体已经鉴定的也
: 有。
: 如Sunnyday说的污染情况也很可能。你需要根据自己数据判断是否make sense。
: WB有时很tricky，浓度过低或未优化时可能就测不出。所以你的蛋白质在纯化的线粒体
: 未检测出来，而IP后检测出来，也不是少见。
: 如果能否分离到足够量，跑胶做质谱分析可能会提供你更多的信息。
:
: contamination，
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u**********d
发帖数: 573 | 6 它们本来是两条平行线，但是细胞被破碎后被人为地放在了同一个环境里，发生相互作
用还是可能的。
contamination，
【在 l****j 的大作中提到】
: 我从细胞中分离纯化的ER和mitochondria，检测过marker蛋白没有相互contamination，
: 细胞转染过 HA-tag 的 ER protein，WB验证只在ER和MAM(mitochondria associated
: ER membrane)存在，纯化的线粒体中没有发现此蛋白。
: 在whole cell lysate用 HA-agarose Immunoprecipitation,在同一张膜上
: immunoblotting 两个 mitochondria inner membrane protein（mito protein 1，2）
: 竟然发现和mito protein 1 有 binding,
: 分别在不同细胞器中的蛋白质，有可能binding吗？
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m*******n
发帖数: 387 | 7 lz这个问题我现在也遇到了，不过是根据文献报道的
能不能给我一个分离mitochondria，ER，和nuclear的protocol
我去确认下我的蛋白是不是真的不在同一个细胞器里
现在找不到分离这三个细胞器的protocol
mitochondria， cytoplasm 和nuclear的也行
多谢啦！
contamination，
【在 l****j 的大作中提到】
: 我从细胞中分离纯化的ER和mitochondria，检测过marker蛋白没有相互contamination，
: 细胞转染过 HA-tag 的 ER protein，WB验证只在ER和MAM(mitochondria associated
: ER membrane)存在，纯化的线粒体中没有发现此蛋白。
: 在whole cell lysate用 HA-agarose Immunoprecipitation,在同一张膜上
: immunoblotting 两个 mitochondria inner membrane protein（mito protein 1，2）
: 竟然发现和mito protein 1 有 binding,
: 分别在不同细胞器中的蛋白质，有可能binding吗？
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u****i
发帖数: 1679 | |
i*****g
发帖数: 11893 | 9 subcellular organelle isolation never pure enough |
l****j
发帖数: 70 | 10 nuclear 没有分过，只有ER和mitochondria 的
cytoplasm 和nuclear 有kit可以用
Nat Protoc. 2009;4(11):1582-90. Epub 2009 Oct 8.
Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal
tissues and cells.
Wieckowski MR, Giorgi C, Lebiedzinska M, Duszynski J, Pinton P.
SourceDepartment of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology,
Warsaw, Poland. m**********[email protected]
PMID:19816421
【在 m*******n 的大作中提到】
: lz这个问题我现在也遇到了，不过是根据文献报道的
: 能不能给我一个分离mitochondria，ER，和nuclear的protocol
: 我去确认下我的蛋白是不是真的不在同一个细胞器里
: 现在找不到分离这三个细胞器的protocol
: mitochondria， cytoplasm 和nuclear的也行
: 多谢啦！
:
: contamination，
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l****j
发帖数: 70 | 11 我发现的是线粒体内膜蛋白质Complex III, Fes 和转染进去的ER蛋白有binding，
但在ER和MAM里没发现有Complex III, Fes，
另一个线粒体内膜蛋白Complex V β 有部分在MAM，但这个蛋白应该是在matrix一侧的，
很多文献说MAM应该包括ER和线粒体外膜部分
我也想从sorting这方面入手，binding是因为受过表达蛋白影响，但是又没发现在ER有
那个binding的蛋白，
有没有可能是抗体只识别sorting到线粒体之后的片段，在ER的里要多出一段序列，所
以抗体识别不出来？
【在 s******y 的大作中提到】
: 会不会是你把膜粉碎的时候把两种来源的膜都弄碎了然后弄到了一起？
: ER 在mitochonrida 分裂的时期好像是有结合的。但是这个互相作用貌似
: 只对于线粒体外膜蛋白有效。
: 另外一个可能性就是你过表达的蛋白太多了，出现了aggregate or misfolding,
: 然后把本来应该sort 到线粒体里的蛋白给留住了。
:
: contamination，
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l****j
发帖数: 70 | 12 多谢提供的参考文献，
我研究的那个ER蛋白对线粒体有很多调节作用，比如ATP，O2，还有对线粒体复合体的
assembly都有影响，对钙离子也有调节作用
我想解决ER蛋白怎么对线粒体内膜有影响的，为甚么能binding在一起
【在 l**********1 的大作中提到】
: LZ is doing Mitochondrial Ca(2+) apoptosis works now?
: If Yes,
: pls refer below figure which just cited from
: Giorgi C et al. (2012)
: Mitochondrial Ca(2+) and apoptosis.
: Cell Calcium. 52: 36-43.
: web link:
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22480931
: more references:
: Patergnani S et al. (2011)
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 De rien.
plus this one:
Shioda N et al. (2012)
Expression of a Truncated Form of the Endoplasmic Reticulum Chaperone
Protein, σ1 Receptor, Promotes Mitochondrial Energy Depletion and Apoptosis
JBC 287: 23318-31.
Abstract
The σ1 receptor (σ(1)R) regulates endoplasmic reticulum (ER)/mitochondrial
interorganellar Ca(2+) mobilization through the inositol 1,4,5-
trisphosphate receptor (IP(3)R). Here, we observed that expression of a
novel splice variant of σ(1)R, termed short form σ(1)R (σ(1)SR), has a
detrimental effect on mitochondrial energy production and cell survival. σ(
1)SR mRNA lacks 47 ribonucleotides encoding exon 2, resulting in a
frameshift and formation of a truncated receptor. σ(1)SR localizes
primarily in the ER at perinuclear regions and forms a complex with σ(1)R
but not with IP(3)R in the mitochondrion-associated ER membrane.
Overexpression of both σ(1)R and the truncated isoform promotes
mitochondrial elongation with increased ER mitochondrial contact surface. σ
(1)R overexpression increases the efficiency of mitochondrial Ca(2+) uptake
in response to IP(3)R-driven stimuli, whereas σ(1)SR overexpression reduces
it. Most importantly, σ(1)R promotes ATP production via increased
mitochondrial Ca(2+) uptake, promoting cell survival in the presence of ER
stress. By contrast, σ(1)SR suppresses ATP production following ER stress,
enhancing cell death. Taken together, the newly identified σ(1)SR isoform
interferes with σ(1)R function relevant to mitochondrial energy production
under ER stress conditions, promoting cellular apoptosis.
PubMed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22619170
【在 l****j 的大作中提到】
: 多谢提供的参考文献，
: 我研究的那个ER蛋白对线粒体有很多调节作用，比如ATP，O2，还有对线粒体复合体的
: assembly都有影响，对钙离子也有调节作用
: 我想解决ER蛋白怎么对线粒体内膜有影响的，为甚么能binding在一起
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k******0
发帖数: 1073 | 14 complex iii和ATP synthase都是线粒体内膜丰量蛋白质，污染的可能性很大。
的，
【在 l****j 的大作中提到】
: 我发现的是线粒体内膜蛋白质Complex III, Fes 和转染进去的ER蛋白有binding，
: 但在ER和MAM里没发现有Complex III, Fes，
: 另一个线粒体内膜蛋白Complex V β 有部分在MAM，但这个蛋白应该是在matrix一侧的，
: 很多文献说MAM应该包括ER和线粒体外膜部分
: 我也想从sorting这方面入手，binding是因为受过表达蛋白影响，但是又没发现在ER有
: 那个binding的蛋白，
: 有没有可能是抗体只识别sorting到线粒体之后的片段，在ER的里要多出一段序列，所
: 以抗体识别不出来？
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l****j
发帖数: 70 | 15 谢谢,我会试一试
【在 k******0 的大作中提到】
: complex iii和ATP synthase都是线粒体内膜丰量蛋白质，污染的可能性很大。
:
: 的，
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l****j
发帖数: 70 | 16 怎么个污染？IP非特异性结合？
【在 k******0 的大作中提到】
: complex iii和ATP synthase都是线粒体内膜丰量蛋白质，污染的可能性很大。
:
: 的，
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l****j
发帖数: 70 | 17 我看完了这篇文章，他们主要是说通过调节ER的Ca去调节mito的Ca，然后影响mito功能，
我研究的蛋白质也能调节Ca，但是我还是不清楚蛋白质结合的机制
Apoptosis
mitochondrial
【在 l**********1 的大作中提到】
: De rien.
: plus this one:
: Shioda N et al. (2012)
: Expression of a Truncated Form of the Endoplasmic Reticulum Chaperone
: Protein, σ1 Receptor, Promotes Mitochondrial Energy Depletion and Apoptosis
: JBC 287: 23318-31.
: Abstract
: The σ1 receptor (σ(1)R) regulates endoplasmic reticulum (ER)/mitochondrial
: interorganellar Ca(2+) mobilization through the inositol 1,4,5-
: trisphosphate receptor (IP(3)R). Here, we observed that expression of a
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s******y
发帖数: 28562 | 18 听起来是很奇怪。你能不能用免疫荧光来定位一下这两个蛋白在细胞内的位置？
最好用confocal.
的，
【在 l****j 的大作中提到】
: 我发现的是线粒体内膜蛋白质Complex III, Fes 和转染进去的ER蛋白有binding，
: 但在ER和MAM里没发现有Complex III, Fes，
: 另一个线粒体内膜蛋白Complex V β 有部分在MAM，但这个蛋白应该是在matrix一侧的，
: 很多文献说MAM应该包括ER和线粒体外膜部分
: 我也想从sorting这方面入手，binding是因为受过表达蛋白影响，但是又没发现在ER有
: 那个binding的蛋白，
: 有没有可能是抗体只识别sorting到线粒体之后的片段，在ER的里要多出一段序列，所
: 以抗体识别不出来？
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k******0
发帖数: 1073 | 19 这两个蛋白质都是氧化磷酸化链复合体III和V的亚基，位于内膜基质这一侧。外膜内膜
的蛋白质是cofocal无法区别，线粒体和ER有相连的膜，因此cofocal会有部分重叠。所
以无法证实这两个线粒体蛋白质是否和ER目标蛋白质相互作用。
【在 s******y 的大作中提到】
: 听起来是很奇怪。你能不能用免疫荧光来定位一下这两个蛋白在细胞内的位置？
: 最好用confocal.
:
: 的，
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k******0
发帖数: 1073 | 20 我怀疑你的蛋白质被这个氧化磷酸化链的复合体污染。因为它们是线粒体膜的主要蛋白
质成分，是分离线粒体蛋白质的主要污染源。你可以用其它抗体检测一下其它亚基的存
在。
污染有很多途径。可能这些膜蛋白质复合体溶解性差，容易变性，就很容易沾粘在HA，
resin或你的目标蛋白质上，如果是前两个，你可以做很好的control证明没有污染。如
果非特异性沾在你的目标蛋白质上，就很难鉴别。你可能需要分离到纯的复合体才行。
呼吸链蛋白质亚基除了形成5个复合体外，跟其它蛋白质的相互作用还很少见。
【在 l****j 的大作中提到】
: 怎么个污染？IP非特异性结合？
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j******1
发帖数: 1315 | 21 只要能编出个故事来能发表就能Binding，否则就不能 |
l****j
发帖数: 70 | 22 照过，
用的是ER蛋白质（RFP-plasmid）和mitotracker(green)的co-stain
但是照的不清楚,不像overlay，只是connection
【在 s******y 的大作中提到】
: 听起来是很奇怪。你能不能用免疫荧光来定位一下这两个蛋白在细胞内的位置？
: 最好用confocal.
:
: 的，
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s******y
发帖数: 28562 | 23 你这个问题看来比我预想的还要复杂。
不过呢，看起来大部分红色的蛋白都在他们应该在的地方，而且颜色均匀没有
明显的亮点，所以不太可能有aggregate. 所以大概可以排除那个可能性了。
当然，要彻底排除那个可能性的话，你最好在细胞裂解后进行低速离心，
把沉淀物分出来后看看到底有没有你表达的蛋白。
第二，你说你分开制备ER和mitochondira 的时候看不到那个complex III
蛋白在ER fraction里。所以，我觉得最有可能的是用lysate 来做的时候，
可能就是因为把膜都打碎了混到了一起，导致出现了artifact.
【在 l****j 的大作中提到】
: 照过，
: 用的是ER蛋白质（RFP-plasmid）和mitotracker(green)的co-stain
: 但是照的不清楚,不像overlay，只是connection
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l****j
发帖数: 70 | 24 有可能
【在 s******y 的大作中提到】
: 你这个问题看来比我预想的还要复杂。
: 不过呢，看起来大部分红色的蛋白都在他们应该在的地方，而且颜色均匀没有
: 明显的亮点，所以不太可能有aggregate. 所以大概可以排除那个可能性了。
: 当然，要彻底排除那个可能性的话，你最好在细胞裂解后进行低速离心，
: 把沉淀物分出来后看看到底有没有你表达的蛋白。
: 第二，你说你分开制备ER和mitochondira 的时候看不到那个complex III
: 蛋白在ER fraction里。所以，我觉得最有可能的是用lysate 来做的时候，
: 可能就是因为把膜都打碎了混到了一起，导致出现了artifact.
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l**********1
发帖数: 5204 | 25 LZ 一篇 Molecular Cell 的有或无 可能就取决于 你那句 '有可能' true or
fraud |
