f******p
发帖数: 178 | 1 蓝白菌落加起来30个左右，白色菌落总不够挑
连续三次都这样，请大家帮我分析一下原因？ |
b******n
发帖数: 4225 | 2 1. 感受态的问题，是自己制备的还是买的？
2. DNA purification有问题，比如说wash buffer没有处理干净，也就是说还有乙醇残
留，导致连接效率低，转化效率也低
3. 如果是chemical transformation，检查heat shock的温度是不是42度。如果是
electroporation transformation，是不是电击的时候time constant很低，甚至有arc
4. plate的antibiotics种类是不是对，浓度是不是正确
可能的问题很多，最好找老手一步一步教你和帮你trouble shooting。没经验自己分析
很费时费力。
【在 f******p 的大作中提到】
: 蓝白菌落加起来30个左右，白色菌落总不够挑
: 连续三次都这样，请大家帮我分析一下原因？
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f******p
发帖数: 178 | 3 非常感谢给出一些可能原因。上一个基因克隆的很顺利。换了个基因就开始出问题了。
1. 我是买的感受态细菌。JM109, >10*8
2. 直接克隆的PCR产物。上一个基因就这样, 挺顺利的。再说这个只影响白斑数量吧？
白斑的比例还可以，就是总体数量低。
3. 确定是42度。这个也只影响白斑数量吧？
4. antibiotics没问题
还有可能是什么问题？LB agar两年前的。但两个月前克隆另一个基因还很好啊。
arc
【在 b******n 的大作中提到】
: 1. 感受态的问题，是自己制备的还是买的？
: 2. DNA purification有问题，比如说wash buffer没有处理干净，也就是说还有乙醇残
: 留，导致连接效率低，转化效率也低
: 3. 如果是chemical transformation，检查heat shock的温度是不是42度。如果是
: electroporation transformation，是不是电击的时候time constant很低，甚至有arc
: 4. plate的antibiotics种类是不是对，浓度是不是正确
: 可能的问题很多，最好找老手一步一步教你和帮你trouble shooting。没经验自己分析
: 很费时费力。
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s******s
发帖数: 13035 | 4 啥叫不够挑？先抽几个看看
【在 f******p 的大作中提到】
: 蓝白菌落加起来30个左右，白色菌落总不够挑
: 连续三次都这样，请大家帮我分析一下原因？
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f******p
发帖数: 178 | 5 我做多倍体，想每个种挑12个克隆测序
【在 s******s 的大作中提到】
: 啥叫不够挑？先抽几个看看
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f******p
发帖数: 178 | 6 恳请大家再帮忙找找原因。目前耗时耗力耗钱啊。
【在 f******p 的大作中提到】
: 我做多倍体，想每个种挑12个克隆测序
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h******y
发帖数: 351 | 7 如果这是特例的话（比如你克隆其他基因都能拿到很多克隆），可能你要克隆的这段DN
A能产生对E coli有害的产物。用个ORFfinder试试分析一下。
【在 f******p 的大作中提到】
: 非常感谢给出一些可能原因。上一个基因克隆的很顺利。换了个基因就开始出问题了。
: 1. 我是买的感受态细菌。JM109, >10*8
: 2. 直接克隆的PCR产物。上一个基因就这样, 挺顺利的。再说这个只影响白斑数量吧？
: 白斑的比例还可以，就是总体数量低。
: 3. 确定是42度。这个也只影响白斑数量吧？
: 4. antibiotics没问题
: 还有可能是什么问题？LB agar两年前的。但两个月前克隆另一个基因还很好啊。
:
: arc
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f******p
发帖数: 178 | 8 非常感谢你的建议
DN
【在 h******y 的大作中提到】
: 如果这是特例的话（比如你克隆其他基因都能拿到很多克隆），可能你要克隆的这段DN
: A能产生对E coli有害的产物。用个ORFfinder试试分析一下。
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