x**e
发帖数: 163 | 1 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
就不行了？
望各位不吝指教。 |
g*r
发帖数: 2116 | 2 遇到过这个情况 解决方法是把PCR产物稀释很多倍作为模板 比如你可以试试 1/100，1
/1000, 1/10000....
如果做出来了记得给我发个包子 哈哈哈哈
【在 x**e 的大作中提到】
: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。
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D********0
发帖数: 409 | 3 1. dilute template，
2. 如果不work，把引物往里设计，primer binding的时候不能perfect match到原来引
物位置。
3. 如果不purify PCR product，里面焦磷酸盐之类的会降低PCR specificity and
sensitivity。
4. qiagen hotstar kit for amplification。
【在 x**e 的大作中提到】
: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。
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x**e
发帖数: 163 | 4 1/10000？我试过1/10稀释，以为够稀的了，因为条带本来就很弱，过柱纯化后就更少
了，结果没出来。我再试试更稀的看看。
我是用来构建载体的，引物是从ATG到TGA，所以也没办法往里面缩。
主要想不通的是其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么
纯化后做模板就不行了呢？ |
s******y
发帖数: 28562 | 5 在我理解中，因为你的第一次的产品不是象你想像的那么纯的，而是有很多杂带，只不
过在胶上你不一定能看到而已。如果直接扩，一个常见的结果就是那些杂带扩得比你想
要的带更多，结果就成了一个均匀的smear, 所以你什么带都看不见了。
【在 x**e 的大作中提到】
: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。
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x**e
发帖数: 163 | 6 因为不好扩，第一次用的是touch down，扩出约10条带，目标带3.2k比较弱，挖胶回收
后一起有20个ng。二次扩增没有看到smear，倒是有几条其他大小的杂带。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 7 说个不相干的
如果这个基因的序列已知
直接去合成吧
现在合成也没多少钱
而且挺快的 |
f******p
发帖数: 178 | 8 为什么不做克隆呢？条带弱点没什么影响。
【在 x**e 的大作中提到】
: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。
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d**l
发帖数: 1546 | 9 先把条带切出来， 然后用gel purification kit纯化， 然后再用普通的pcr
purification kit纯化， 然后再做第二轮pcr
一定要两轮纯化
【在 x**e 的大作中提到】
: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 对了，条带弱一点也可以做TOPO blunt end cloning的
用电转化
应该没什么问题 |
x**e
发帖数: 163 | 11 3k多的片段，合成的话应该很贵吧。
一起就10来个ng的产物，也试过上TOPO，因为酶切位点的保护碱基就用的cacc，用的买
的感受态，上不去，怀疑TOPO自身只有2.6k，装不下3k的东西 |
j****x
发帖数: 1704 | 12 3kb以上有专用的topo大片段kit
【在 x**e 的大作中提到】
: 3k多的片段，合成的话应该很贵吧。
: 一起就10来个ng的产物，也试过上TOPO，因为酶切位点的保护碱基就用的cacc，用的买
: 的感受态，上不去，怀疑TOPO自身只有2.6k，装不下3k的东西
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N****n
发帖数: 294 | 13 Can you raise your primers annealing temperature by extending a few more
bases? I had the experience with shorter primer and lower annealing
temperature without success. Increasing the length of primer as well as the
annealing temperature solved the problem. Good luck |
m*******u
发帖数: 173 | 14 Is it a high GC template? If so, add DMSO to enhance the PCR efficiency. |
