q*****d 发帖数: 445 | 1 这篇文章的方法我怎么看不明白呢?如果我看明白了,就是它有明显的错误,但我相信
NBT是不可能有错误的,尤其是这位大神实验室经常出一些Nature, Science的,所以说
还是我没有看明白。现在还是直奔主题吧!问题幼稚,还望大神们多多指教!
文章链接在这里:http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n3/full/nbt.1526.html
我们是想用它的方法进行细胞转座子分析,看看细胞内的转座子都跑哪里去了。因此我
想follow他们的LM-PCR方法。
原文272页的Pyrosequencing说到:把转座子的左边用BfaI切,右边用NlaIII切,然后
与合成的linker连接:引物的设计如下:
To make the BfaI linker, the following oligonucleotide sequences were
annealed together using standard protocols, top strand 5’-
GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ and bottom strand 5’-
TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’. As for the NlaIII linker, the following oligo-
nucleotide sequences were annealed together using standard protocols, top
strand5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG-3¢ and bottom strand 5’
- GTCCCTTAAGCGGAGCC-3’.
我分析了一下这两对引物,发现他们根本不可能和BfaI和NlaIII产生的缺口连接。结果
见图片:
另外,他们连接之后还要用BamHI或XhoI切一刀,不明白是啥意思?
第一轮PCR我能理解,就是从linker和转座子上面分别取一段PCR,但是第二段加什么
FusA barcode我就不理解了,并且原文也没有提供引物的序列!
牛人给讲解一下啊!我就是想用这个技术,所以本篇文章我只看方法这部分,医学这方
面我也不懂,麻烦了! | q*****d 发帖数: 445 | | b******n 发帖数: 4225 | 3 不是牛人,不过感兴趣看了一下
感觉方法没问题啊,你的图好像分析有问题
不要自己将oligo转成reverse complementary的形式,用原始序列
这是一个三片段链接,转座子,左边oligo linker,右边oligo linker连成一个环
转座子可能正向插入,也可能反向插入,
所以需要在转座子DR/IR用BamHI/XhoI切一下好进行PCR扩增
FusionA/B是pyrosequencing的adaptor,barcode是用来区分多个样品的标记
【在 q*****d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这篇文章的方法我怎么看不明白呢?如果我看明白了,就是它有明显的错误,但我相信 : NBT是不可能有错误的,尤其是这位大神实验室经常出一些Nature, Science的,所以说 : 还是我没有看明白。现在还是直奔主题吧!问题幼稚,还望大神们多多指教! : 文章链接在这里:http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n3/full/nbt.1526.html : 我们是想用它的方法进行细胞转座子分析,看看细胞内的转座子都跑哪里去了。因此我 : 想follow他们的LM-PCR方法。 : 原文272页的Pyrosequencing说到:把转座子的左边用BfaI切,右边用NlaIII切,然后 : 与合成的linker连接:引物的设计如下: : To make the BfaI linker, the following oligonucleotide sequences were : annealed together using standard protocols, top strand 5’-
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