q*****d
发帖数: 445 | 1 这篇文章的方法我怎么看不明白呢？如果我看明白了，就是它有明显的错误，但我相信
NBT是不可能有错误的，尤其是这位大神实验室经常出一些Nature, Science的，所以说
还是我没有看明白。现在还是直奔主题吧！问题幼稚，还望大神们多多指教！
文章链接在这里：http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n3/full/nbt.1526.html
我们是想用它的方法进行细胞转座子分析，看看细胞内的转座子都跑哪里去了。因此我
想follow他们的LM-PCR方法。
原文272页的Pyrosequencing说到：把转座子的左边用BfaI切，右边用NlaIII切，然后
与合成的linker连接：引物的设计如下：
To make the BfaI linker, the following oligonucleotide sequences were
annealed together using standard protocols, top strand 5’-
GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ and bottom strand 5’-
TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’. As for the NlaIII linker, the following oligo-
nucleotide sequences were annealed together using standard protocols, top
strand5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG-3￠ and bottom strand 5’
- GTCCCTTAAGCGGAGCC-3’.
我分析了一下这两对引物，发现他们根本不可能和BfaI和NlaIII产生的缺口连接。结果
见图片：
另外，他们连接之后还要用BamHI或XhoI切一刀，不明白是啥意思？
第一轮PCR我能理解，就是从linker和转座子上面分别取一段PCR，但是第二段加什么
FusA barcode我就不理解了，并且原文也没有提供引物的序列！
牛人给讲解一下啊！我就是想用这个技术，所以本篇文章我只看方法这部分，医学这方
面我也不懂，麻烦了！ | q*****d
发帖数: 445 | | b******n
发帖数: 4225 | 3 不是牛人，不过感兴趣看了一下
感觉方法没问题啊，你的图好像分析有问题
不要自己将oligo转成reverse complementary的形式，用原始序列
这是一个三片段链接，转座子，左边oligo linker，右边oligo linker连成一个环
转座子可能正向插入，也可能反向插入，
所以需要在转座子DR/IR用BamHI/XhoI切一下好进行PCR扩增
FusionA/B是pyrosequencing的adaptor,barcode是用来区分多个样品的标记
【在 q*****d 的大作中提到】
: 这篇文章的方法我怎么看不明白呢？如果我看明白了，就是它有明显的错误，但我相信
: NBT是不可能有错误的，尤其是这位大神实验室经常出一些Nature, Science的，所以说
: 还是我没有看明白。现在还是直奔主题吧！问题幼稚，还望大神们多多指教！
: 文章链接在这里：http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n3/full/nbt.1526.html
: 我们是想用它的方法进行细胞转座子分析，看看细胞内的转座子都跑哪里去了。因此我
: 想follow他们的LM-PCR方法。
: 原文272页的Pyrosequencing说到：把转座子的左边用BfaI切，右边用NlaIII切，然后
: 与合成的linker连接：引物的设计如下：
: To make the BfaI linker, the following oligonucleotide sequences were
: annealed together using standard protocols, top strand 5’-
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