c**********r
发帖数: 109 | 1 cryoEM分辨率较高，什么情况下做不了cryoEM？
最近看了一篇文章，nenetive straining，只到20多A的分辨率，好奇为什么没做
cryoEM |
s******y
发帖数: 28562 | 2 我对这个是三脚猫。但是在我的印象里，cryoEM的样品制备可麻烦了。
而nenetive straining 则非常容易做。所以除非有必要，否则没有人自讨苦吃去做
cryo。
【在 c**********r 的大作中提到】
: cryoEM分辨率较高，什么情况下做不了cryoEM？
: 最近看了一篇文章，nenetive straining，只到20多A的分辨率，好奇为什么没做
: cryoEM
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i***0
发帖数: 160 | 3 作cryo-EM的难度相当于蛋白结晶，一般要耗３－６月摸索条件。快速冰冻来防止冰晶
的形成，在偶然条件下形成单分子冰层（保持液相的特征）。需要有液氮ｈｏｌｄｅｒ
的电镜，和空气湿度的严格要求来确保图像质量。要达到高分辨率，要收集足够的图像
，是个体力活。目前的软件水平也参差不齐，ｐｉｃｋ ｐａｒｔｉｃｌｅ基本靠手，
几万个ｐａｒｔｉｃｌｅ，坑爹啊。目前ｃｒｙｏＥＭ最成功的就是病毒颗粒的结构，
因为它高度对称，可以大幅缩小到达高分辨率的图像数，所以才有所谓几个Ａ的分辨率
出现。
Negative stain相对要简单很多，对电镜要求也少一些。上手快，成功率高，只要蛋白
不聚集，找到合适的浓度把蛋白分子颗粒均匀分布在ｇｒｉｄ上，ｓｔａｉｎ合适，图
像对比度会比ｃｒｙｏＥＭ清晰很多。但因为有重金属铀的覆盖，解出来的结构分辨率
就上不去了。
最牛的是２Ｄ－结晶，用电镜作ｘ－ｒａｙ衍射和数据收集，用晶体学的运算解出二维
晶体的结构。不过目前只有水通道这一个成功的例子。 |
c********9
发帖数: 562 | 4 不做cryo-em, 主要还是这个技术不够普及。 |
i***0
发帖数: 160 | 5 作为一项技术，它确实不够普及，可是最近电镜技术的发展也让这个老技术焕发新的生
命力，比如膜蛋白的晶体结构多是通过修饰稳定后才能结晶，可是这样带来的稳态结构
是否能反映天然状态一直是个困扰。ｃｒｙｏ－ＥＭ是液相状态的结构，可以反映大分
子颗粒的ｄｙｎａｍｉｃ的构象。一个经典就是ＡＴＰａｓｅ质子通道的多态性（见
Steve Lutke 的文章）。如果可以合作， 还是挺有意思的。 |
s******c
发帖数: 331 | 6 电镜的优势是很大的，当然技术问题也是很多的。但是用cryo EM来做membrane
protein dynamics的东西，局限性还是很大，不如其它很多的biophysics的手段好。
【在 i***0 的大作中提到】
: 作为一项技术，它确实不够普及，可是最近电镜技术的发展也让这个老技术焕发新的生
: 命力，比如膜蛋白的晶体结构多是通过修饰稳定后才能结晶，可是这样带来的稳态结构
: 是否能反映天然状态一直是个困扰。ｃｒｙｏ－ＥＭ是液相状态的结构，可以反映大分
: 子颗粒的ｄｙｎａｍｉｃ的构象。一个经典就是ＡＴＰａｓｅ质子通道的多态性（见
: Steve Lutke 的文章）。如果可以合作， 还是挺有意思的。
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l**********1
发帖数: 5204 | 7 sure, likes Solid or In Cell NMR
【在 s******c 的大作中提到】
: 电镜的优势是很大的，当然技术问题也是很多的。但是用cryo EM来做membrane
: protein dynamics的东西，局限性还是很大，不如其它很多的biophysics的手段好。
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e****s
发帖数: 1125 | 8 是外行，没机会做，但一直很感兴趣。
Cryo EM最大的优势应该还是做大的Complex吧？Protein complex一直是个挑战。晶体
和核磁做Complex的结构都有很大的挑战，个人感觉Cryo做大的复合物的结构到真的是
优势潜力巨大。
版上有没有专家出来现身说法下。
【在 s******c 的大作中提到】
: 电镜的优势是很大的，当然技术问题也是很多的。但是用cryo EM来做membrane
: protein dynamics的东西，局限性还是很大，不如其它很多的biophysics的手段好。
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c**********r
发帖数: 109 | 9 蛋白结晶 sometimes is really easy, cyro-EM is difficult for most of the time
【在 i***0 的大作中提到】
: 作cryo-EM的难度相当于蛋白结晶，一般要耗３－６月摸索条件。快速冰冻来防止冰晶
: 的形成，在偶然条件下形成单分子冰层（保持液相的特征）。需要有液氮ｈｏｌｄｅｒ
: 的电镜，和空气湿度的严格要求来确保图像质量。要达到高分辨率，要收集足够的图像
: ，是个体力活。目前的软件水平也参差不齐，ｐｉｃｋ ｐａｒｔｉｃｌｅ基本靠手，
: 几万个ｐａｒｔｉｃｌｅ，坑爹啊。目前ｃｒｙｏＥＭ最成功的就是病毒颗粒的结构，
: 因为它高度对称，可以大幅缩小到达高分辨率的图像数，所以才有所谓几个Ａ的分辨率
: 出现。
: Negative stain相对要简单很多，对电镜要求也少一些。上手快，成功率高，只要蛋白
: 不聚集，找到合适的浓度把蛋白分子颗粒均匀分布在ｇｒｉｄ上，ｓｔａｉｎ合适，图
: 像对比度会比ｃｒｙｏＥＭ清晰很多。但因为有重金属铀的覆盖，解出来的结构分辨率
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d****b
发帖数: 262 | 10 不做cryo的原因很大可能就是蛋白比较小，在cryo的条件下衬度低，不容易进行后期的
数据处理。
我做七年冷冻电镜了
【在 c**********r 的大作中提到】
: cryoEM分辨率较高，什么情况下做不了cryoEM？
: 最近看了一篇文章，nenetive straining，只到20多A的分辨率，好奇为什么没做
: cryoEM
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b****z
发帖数: 5 | 11 楼上回复那么多，只发现这一个懂的，哈哈哈
兄弟在哪个实验室混？
不做cryo的原因很大可能就是蛋白比较小，在cryo的条件下衬度低，不容易进行后期的
数据处理。我做七年冷冻电镜了
【在 d****b 的大作中提到】
: 不做cryo的原因很大可能就是蛋白比较小，在cryo的条件下衬度低，不容易进行后期的
: 数据处理。
: 我做七年冷冻电镜了
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F*Q
发帖数: 3259 | 12 乱弹一下，各位牛人不要见笑：
CryoEM的历史比起蛋白质晶体学的历史并不短多少，但是它的竞争力却远远不可和蛋白
质晶体学相提并论，研究对象的困难是一个因素，成本高昂也是一个因素，但最大的因
素恐怕是没有找到能够充分发挥学科优势的方展方向。拿自己的弱项（分辨率）拼命去
和 别的学科的长项比，效果会怎么样？ |
m********r
发帖数: 124 | 13 how about solution NMR?
time
【在 c**********r 的大作中提到】
: 蛋白结晶 sometimes is really easy, cyro-EM is difficult for most of the time
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F*Q
发帖数: 3259 | 14 对于少数真正热爱科学的人来说，也许是不错的方向，对于大多数需要以谋生为主的人
来说恐怕不是个好的行当。
【在 m********r 的大作中提到】
: how about solution NMR?
:
: time
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 plus math/cs/tatistics or theoretical physics at least above Master
graduated level likes Tsinghua Univ or PKU
unless don't touch MD of solution 3D or 4D NMR
【在 F*Q 的大作中提到】
: 对于少数真正热爱科学的人来说，也许是不错的方向，对于大多数需要以谋生为主的人
: 来说恐怕不是个好的行当。
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n*********p
发帖数: 151 | 16 如果真对Science感兴趣，去做optics，laser 和spectroscopy，电镜在生物学上的应
用已经到头了。Cryo,Tomo等只是做电镜的搞的没价值小把戏。 |
m********r
发帖数: 124 | 17 how about x-ray crystallography plus solution NMR?
【在 F*Q 的大作中提到】
: 对于少数真正热爱科学的人来说，也许是不错的方向，对于大多数需要以谋生为主的人
: 来说恐怕不是个好的行当。
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c******T
发帖数: 17 | 18 能展开分析一下么？
我也对cyro-ET很感兴趣，觉得对于不适于结晶的生物样品，这个技术很强大。
【在 n*********p 的大作中提到】
: 如果真对Science感兴趣，去做optics，laser 和spectroscopy，电镜在生物学上的应
: 用已经到头了。Cryo,Tomo等只是做电镜的搞的没价值小把戏。
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z********i
发帖数: 610 | 19 cryo-ET 分辨率太低，也就能看个大概。看原位的东西，对样品的厚度有要求。
【在 c******T 的大作中提到】
: 能展开分析一下么？
: 我也对cyro-ET很感兴趣，觉得对于不适于结晶的生物样品，这个技术很强大。
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