n********e
发帖数: 1630 | 1 大家好，
有个western transfer的technical的问题。我们lab用的是一个很笨重的biorad的semi
-dry transfer 仪器。我刚开始做western，transfer的效率总是很差。
protein ladder用的是5ul，
manual上推荐mini gel，8.5cm x 5.5 cm，用10v-15v，30min
我开始用过25v，总是看到有的ladder 到了下面的filter paper上面，同时还有ladder
在gel上面，如果时间长点，gel上就看不到ladder。
后来我用15v，推荐的，40min-60min，还是看到有ladder在gel上面，但是没有在
filter paper上面。说明这个voltage很合适的，不会over transfer。但是高分子量的
ladder， 50kd以上的，总是转不完全。
我的protein只有20kd，理论上根据ladder来看，应该都转过去了。可是我的western跟
同样的sample，在其他lab做的，结果就不一样。抗体都是按照他们的catalog number
买的。但是detection limit少了一个数量级。
请问有用过semi dry transfer的人，有好的建议吗？
其他lab用的是wet transfer，我亲自做过，都是所有的ladder都转过去了，也看不到
over transfer，我们的membrane都是pvdf，一模一样的。
谢谢了 |
f*c
发帖数: 2726 | 2 你用的membrane的孔径会不会太大了，20KD可能都转出去了
semi
ladder
【在 n********e 的大作中提到】
: 大家好，
: 有个western transfer的technical的问题。我们lab用的是一个很笨重的biorad的semi
: -dry transfer 仪器。我刚开始做western，transfer的效率总是很差。
: protein ladder用的是5ul，
: manual上推荐mini gel，8.5cm x 5.5 cm，用10v-15v，30min
: 我开始用过25v，总是看到有的ladder 到了下面的filter paper上面，同时还有ladder
: 在gel上面，如果时间长点，gel上就看不到ladder。
: 后来我用15v，推荐的，40min-60min，还是看到有ladder在gel上面，但是没有在
: filter paper上面。说明这个voltage很合适的，不会over transfer。但是高分子量的
: ladder， 50kd以上的，总是转不完全。
|
n********e
发帖数: 1630 | 3 不会。manual上说的是>10kd, 我说了，15v的时候不会over flow
【在 f*c 的大作中提到】
: 你用的membrane的孔径会不会太大了，20KD可能都转出去了
:
: semi
: ladder
|
s******s
发帖数: 1584 | 4 好奇怪啊我从来没遇到这样的问题我觉得SemiDry转100KD以下的蛋白比Wet容易操作多
了。
我以前一直是80mM 转一个小时。如果有两块膜的话用100mM，三，四块就再加点。
你可以用两块PVDF叠放然后同时Probe看看下面一块膜上有没有，不过PVDF转穿的可能
性很小啊。 |
