m*********r 发帖数: 49 | 1 正在纯化一个his-tag的蛋白。我想让蛋白结合到Ni柱上后用TEV protease剪切后收集
切下来的蛋白,我觉得这样比用immidazole洗脱纯度高,还省了以后再切tag的麻烦。
现在问题是,老板买了个qiagen的fast start kit (gravity flow的那种), 里面的
Ni-agarose成型了之后像gel一样,不能被重新悬浮,我在加TEV protease洗脱的时候
(4C 过夜),溶液不能完全浸没Ni-agarose,跑胶后和immidazole洗脱的比较发现洗
脱效率很低,我怀疑是因为TEV protease不能很好地与Ni-agarose接触造成的。
请教下有什么推荐的解决方法么?别家卖的Ni-NT好像有那种纯化过程中一直都自由悬
浮的,
不知道哪家的好,或者我的TEV proteasejianqie剪切加洗脱的方案有设么可以改进的
地方?多谢! |
k******0 发帖数: 1073 | 2 你的buffer有没有protease inhibitors,如PMSF, pepstatin等,它们是Tev
protease的抑制剂。有没有DTT,通常我们做Ni-NT不加DTT,好像TEV protease最好有
些DTT存在。还有,in column proteolysis
通常不如in solution digestion有效,多加些protease。 TEV protease特异性很强,
加多了也不怕。如果可以,还可以在20C水解,比4C有效。 |
m*********r 发帖数: 49 | 3 1.Protease inhibitor我只有在裂解细胞的时候加入的,不过在洗脱之前已经wash了几
次,洗脱的时候应该没什么残留了。
2. 我没加DTT,刚看了下别的protocol,貌似也推荐用1 mM DTT,我下次加入试试。(-
_- 第一次试没经验)
3. TEV加入量的问题也值得我多算计一下,多谢回复!
【在 k******0 的大作中提到】 : 你的buffer有没有protease inhibitors,如PMSF, pepstatin等,它们是Tev : protease的抑制剂。有没有DTT,通常我们做Ni-NT不加DTT,好像TEV protease最好有 : 些DTT存在。还有,in column proteolysis : 通常不如in solution digestion有效,多加些protease。 TEV protease特异性很强, : 加多了也不怕。如果可以,还可以在20C水解,比4C有效。
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