v***a
发帖数: 1242 | 1 最近做一个新gene的siRNA做不出，查阅相关paper都提到：The cells were incubated
in antibiotic-free medium for 24 h。我以前做都没有这步骤，只是在
transfection的时候才antibiotic-free。
请教高手这个跟我无法knock down有关系吗，为什么之前要24小时antibiotic-free？
谢谢！ |
v***a
发帖数: 1242 | 2 自己顶一下
incubated
【在 v***a 的大作中提到】
: 最近做一个新gene的siRNA做不出，查阅相关paper都提到：The cells were incubated
: in antibiotic-free medium for 24 h。我以前做都没有这步骤，只是在
: transfection的时候才antibiotic-free。
: 请教高手这个跟我无法knock down有关系吗，为什么之前要24小时antibiotic-free？
: 谢谢！
|
G**********s
发帖数: 74 | 3 同问。
我以前做过一次siRNA，根据一篇paper和公司寄来的instruction上面都没有提到
antibiotic-free medium。 |
j******n
发帖数: 941 | 4 看你做reverse还是forward method了 通常无所谓提前一天放 |
v***a
发帖数: 1242 | 5 自己在网上搜了一把，说使用antibiotic-free medium是为了减少cell death，还有
complex froming的时候也不能有antibiotic。
【在 G**********s 的大作中提到】
: 同问。
: 我以前做过一次siRNA，根据一篇paper和公司寄来的instruction上面都没有提到
: antibiotic-free medium。
|
v***a
发帖数: 1242 | 6 谢谢高手
【在 j******n 的大作中提到】
: 看你做reverse还是forward method了 通常无所谓提前一天放
|
f*****f
发帖数: 195 | 7 是的，抗生素一般跟干涉效率无关，无抗培养基只是为了减少细胞死亡，而且一般只是
lipofectamine 相关试剂。很多公司出的转染试剂，可以直接用含抗生素培养基，如
Hiperfect。即使是lipo，除基因本身外，影响cell death因素：如cell type，
density, etc. Lipo RNAimax也比lipo 2000效率高和毒性小。我一般用rnaimax直接用
含antibotics的medium。
【在 v***a 的大作中提到】
: 自己在网上搜了一把，说使用antibiotic-free medium是为了减少cell death，还有
: complex froming的时候也不能有antibiotic。
|
v***a
发帖数: 1242 | 8 这个回答赞，多谢！
再请教一下高手，试了好几家公司的共8个siRNA duplex，我要看的gene都无法被
knockdown，查到的paper也都使用的我试的其中一家公司的pool，现在有点无计可施了
。RT-PCR和WB都看不到表达有下降。不知道哪儿出了问题。
【在 f*****f 的大作中提到】
: 是的，抗生素一般跟干涉效率无关，无抗培养基只是为了减少细胞死亡，而且一般只是
: lipofectamine 相关试剂。很多公司出的转染试剂，可以直接用含抗生素培养基，如
: Hiperfect。即使是lipo，除基因本身外，影响cell death因素：如cell type，
: density, etc. Lipo RNAimax也比lipo 2000效率高和毒性小。我一般用rnaimax直接用
: 含antibotics的medium。
|
f*****f
发帖数: 195 | 9 拿一个干涉有效的positive control sirna检测，排除是否转染原因。
pool都不行的话，单个希望几乎没有，就只有换pool了。
【在 v***a 的大作中提到】
: 这个回答赞，多谢！
: 再请教一下高手，试了好几家公司的共8个siRNA duplex，我要看的gene都无法被
: knockdown，查到的paper也都使用的我试的其中一家公司的pool，现在有点无计可施了
: 。RT-PCR和WB都看不到表达有下降。不知道哪儿出了问题。
|
K********g
发帖数: 58 | 10 是啊。如果你的转染试剂坏了，你死活也做不出来的。
【在 f*****f 的大作中提到】
: 拿一个干涉有效的positive control sirna检测，排除是否转染原因。
: pool都不行的话，单个希望几乎没有，就只有换pool了。
|
v***a
发帖数: 1242 | 11 转染试剂一般坏是因为什么原因？很容易发生吗？
最近siRNA做得很多，都是新买的一到马上就做。这次又换了一瓶新的，在等结果。
【在 K********g 的大作中提到】
: 是啊。如果你的转染试剂坏了，你死活也做不出来的。
|
