C*******e
发帖数: 4348 | 1 rt
有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
是不是8kb太长了？ |
K****a
发帖数: 161 | 2 不长，可以加DMSO。
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
: 以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
: 这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
: 试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
: 是不是8kb太长了？
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s******y
发帖数: 28562 | 3 加长反应时间，用更多的产品来做E.coli transformation.
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
: 以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
: 这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
: 试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
: 是不是8kb太长了？
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s********r
发帖数: 312 | 4 我原来做的一次也是，用自己的载体10k怎么做也做不出来，没办法在原来载体上做，
一次就搞定。另外quikChange还有XL的版本吧。 |
s*******m
发帖数: 24 | 5 Try 3min/kb extension time. Worked for >10kb plasmids for me every time.
Also double check your primers... |
C*******e
发帖数: 4348 | 6 谢谢楼上各位
我有加了和不加DMSO的对照
也有试过10，20，30，40，50ng template/50 ul reaction
引物有用过Strategen protocol上说的完全互补的
也用过Zhang et al, 2004 Nucleic Acid Research上发表的要不完全overlap的
奇怪的是35个循环出了产物但是都跑well都在胶里
降到18个循环就什么都没有了
但还是转录了，完全没有克隆
重新设计引物什么的18个循环倒是有产物了
但是好多非特异带
只胶纯化8kb的那个带，往下做，没有克隆
想问问大家一般引物终浓度用多少？
PCR条件是根据引物用不同的anealing还是统一用SDM protocol里面的55度，
或者Zhang文章里的52度？ |
C*******e
发帖数: 4348 | 7 我没有用kit，就是自己设计引物用那个protocol而已
【在 s********r 的大作中提到】
: 我原来做的一次也是，用自己的载体10k怎么做也做不出来，没办法在原来载体上做，
: 一次就搞定。另外quikChange还有XL的版本吧。
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C*******e
发帖数: 4348 | 8 不过如果连条带都没有的话用更多产品来做转化也没用吧。。。。
加长反应时间是说比2 min/kb更长嘛
【在 s******y 的大作中提到】
: 加长反应时间，用更多的产品来做E.coli transformation.
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 我会试试用3min/kb
请问你用10kb质粒的时候，50 ul体系用多少模板呢？
引物浓度多少？
谢谢！
【在 s*******m 的大作中提到】
: Try 3min/kb extension time. Worked for >10kb plasmids for me every time.
: Also double check your primers...
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H*******i
发帖数: 196 | 10 如果PCR work（如果你不担心突变的话）就没问题。没有条带得话基本不用转化，直接
换方法
我弄过比较难的是一个10kb质粒里面有两段500bp（共2000bp）反向互补，最后中间找
了个酶分开PCR 连起来的。
关于PCR, 引物不要用完全反向互补序列，如果做deletion，保证5'端不会misanealing
（里面有很多问题，具体和高保真酶的外切酶活性有关）
时间和你的酶有关，Q5我最长1min/KB
个人引物设计退火温度都是65往上的（你非特异性条带多，是不是序列中二级结构很多
？）。。
另外有protocol是完全不overlap， 引物磷酸化，最后连接的，我没试过。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 是的。比方说3min/kb
另外，我常常连条带都看不见也一样能转化，因为Top10 E.coli 实在是太好用了。
另外，如果实在搞不出来，就不要和QuikChange 继续肉搏，完全可以换成overlapping
PCR 来做mutation。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 不过如果连条带都没有的话用更多产品来做转化也没用吧。。。。
: 加长反应时间是说比2 min/kb更长嘛
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X******n
发帖数: 914 | 12 1. Try Top10 cells
2. Use overlap primers, and use Phusion enzyme, add 3 uL DMSO .
3. annealing at 52-58 degree for 5 circles and increase to 58-62 degree for
19 circles.
4. increase you extension time to 16-20mins. |
a*****n
发帖数: 2835 | 13 模板用到250ng试试，跑胶不一定要看到条带，可以直接转化试试
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位
: 我有加了和不加DMSO的对照
: 也有试过10，20，30，40，50ng template/50 ul reaction
: 引物有用过Strategen protocol上说的完全互补的
: 也用过Zhang et al, 2004 Nucleic Acid Research上发表的要不完全overlap的
: 奇怪的是35个循环出了产物但是都跑well都在胶里
: 降到18个循环就什么都没有了
: 但还是转录了，完全没有克隆
: 重新设计引物什么的18个循环倒是有产物了
: 但是好多非特异带
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 谢谢建议！
我用的PfuUltra
可能也会试试别的polymerase
misanealing
【在 H*******i 的大作中提到】
: 如果PCR work（如果你不担心突变的话）就没问题。没有条带得话基本不用转化，直接
: 换方法
: 我弄过比较难的是一个10kb质粒里面有两段500bp（共2000bp）反向互补，最后中间找
: 了个酶分开PCR 连起来的。
: 关于PCR, 引物不要用完全反向互补序列，如果做deletion，保证5'端不会misanealing
: （里面有很多问题，具体和高保真酶的外切酶活性有关）
: 时间和你的酶有关，Q5我最长1min/KB
: 个人引物设计退火温度都是65往上的（你非特异性条带多，是不是序列中二级结构很多
: ？）。。
: 另外有protocol是完全不overlap， 引物磷酸化，最后连接的，我没试过。
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C*******e
发帖数: 4348 | 15 到不是肉搏，比较麻烦，我其实不是做一个基因的mutation
是某个别人实验室来的homemade质粒，里面的RBS还有RBS到MCS一段不行
要换几个碱基
这个再不行当然也有别的方法
只不过希望不要再重新定引物什么的
overlapping
【在 s******y 的大作中提到】
: 是的。比方说3min/kb
: 另外，我常常连条带都看不见也一样能转化，因为Top10 E.coli 实在是太好用了。
: 另外，如果实在搞不出来，就不要和QuikChange 继续肉搏，完全可以换成overlapping
: PCR 来做mutation。
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C*******e
发帖数: 4348 | 16 记下来了！谢谢！
我不能用Top10因为这个质粒本身是Sp resistant的
用的DH5alpha
for
【在 X******n 的大作中提到】
: 1. Try Top10 cells
: 2. Use overlap primers, and use Phusion enzyme, add 3 uL DMSO .
: 3. annealing at 52-58 degree for 5 circles and increase to 58-62 degree for
: 19 circles.
: 4. increase you extension time to 16-20mins.
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C*******e
发帖数: 4348 | 17 没有条带我试过转化了呀，不行啊～
【在 a*****n 的大作中提到】
: 模板用到250ng试试，跑胶不一定要看到条带，可以直接转化试试
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X******n
发帖数: 914 | 18 你的plasmid是Sp resistant为什么不能用TOP10？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 记下来了！谢谢！
: 我不能用Top10因为这个质粒本身是Sp resistant的
: 用的DH5alpha
:
: for
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s******y
发帖数: 28562 | 19 DH5alpha效率太低了。
什么是Sp resistant？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 记下来了！谢谢！
: 我不能用Top10因为这个质粒本身是Sp resistant的
: 用的DH5alpha
:
: for
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 好吧，我话没说全，我的质粒是Spec/Strep resistant的
所以不能用TOP10，which is Strep resistant的
实验室有人试过光用Spec筛
都是假阳性
【在 X******n 的大作中提到】
: 你的plasmid是Sp resistant为什么不能用TOP10？
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C*******e
发帖数: 4348 | 21 Spectinomycin resistant
【在 s******y 的大作中提到】
: DH5alpha效率太低了。
: 什么是Sp resistant？
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z********8
发帖数: 818 | 22
PfuUltra not good. Try phusion and use MAX competent cells from NEB.
Check the GC content of your primer.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢建议！
: 我用的PfuUltra
: 可能也会试试别的polymerase
:
: misanealing
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s******y
发帖数: 28562 | 23 哦。这样的啊。
另外，实在不行的话，你还是改用overlapping PCR吧。随便从vector 上找两个single
restriction site把你要改的地方包含在里面，然后用overlapping PCR把相关片段给
P出来，然后替换进去就可以了。
【在 C*******e 的大作中提到】
: Spectinomycin resistant
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H*******i
发帖数: 196 | 24 1.建议换酶（PCR不work这个我觉得比试条件有效），相对phusion PCR困难模板个人喜
欢Q5，在一些primer靠近terminator的情况，我遇到phusion不work但是Q5（NEB说Q5突
变率低，但我觉得Q5似乎突变率高点，不知道是不是错觉）没问题的情况。
2.spec单独为什么假阳性，这抗性我经常用，不理解。。。
3.comp. cell效率我觉得主要还是和制作方法有关吧，转提纯的质粒做测试得话，我用
TSS转 MG1655 BW25113 DH10B（TOP10是商品名吧） XL1blue 没有观察到特别显著区别
（小于一个数量级），当然做克隆或者PCR产物肯定有些区别。 单个人觉得做克隆效率
10^7-10^8足够了，更高的效率如果长出来几个，很可能是残留模板之类的。另外胶上
看不见确实可以接着做，不过大多情况是费时费力（转化鉴定基本要1.5天），所以我
如果觉得PCR完全没东西，基本就换方法了。 |
a*******a
发帖数: 4233 | 25 我都是很挫的subclone到ta载体里做的。慢么是要慢点，不过心情好呀。
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
: 以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
: 这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
: 试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
: 是不是8kb太长了？
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b*******r
发帖数: 18 | 26 8K不算大，12K的质粒经常做，做了无数点突变，很少有做不出来的。做不出来的话，
基本都是酶的问题，不是所有的酶都适合做QC,phusion保真性很好，QC很少能做出来。
我们用的是Vent，很少有做不出来的，还有就是需要家6-8%的DMSO。循环数18-20足够
了，多了也没用。PCR完了之后酶切，直接转化。
【在 H*******i 的大作中提到】
: 1.建议换酶（PCR不work这个我觉得比试条件有效），相对phusion PCR困难模板个人喜
: 欢Q5，在一些primer靠近terminator的情况，我遇到phusion不work但是Q5（NEB说Q5突
: 变率低，但我觉得Q5似乎突变率高点，不知道是不是错觉）没问题的情况。
: 2.spec单独为什么假阳性，这抗性我经常用，不理解。。。
: 3.comp. cell效率我觉得主要还是和制作方法有关吧，转提纯的质粒做测试得话，我用
: TSS转 MG1655 BW25113 DH10B（TOP10是商品名吧） XL1blue 没有观察到特别显著区别
: （小于一个数量级），当然做克隆或者PCR产物肯定有些区别。 单个人觉得做克隆效率
: 10^7-10^8足够了，更高的效率如果长出来几个，很可能是残留模板之类的。另外胶上
: 看不见确实可以接着做，不过大多情况是费时费力（转化鉴定基本要1.5天），所以我
: 如果觉得PCR完全没东西，基本就换方法了。
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U**l
发帖数: 153 | 27 经常用，但从来不会一次换6个碱基，通常只换2个到顶。
当然也看你6个mutation是在一起还是分开的。
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
: 以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
: 这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
: 试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
: 是不是8kb太长了？
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X******n
发帖数: 914 | 28 6个一起没问题。我也经常用Sp抗性的质粒转top 10，没问题.
8kb一下的pcr突变或deletion,107左右的转化效率足够了，如果是8kb以上的，我通常
都用108-109以上转化效率的细胞。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 29 2.spec单独为什么假阳性，这抗性我经常用，不理解。。。
-——不知道是不是case by case
我说的用spec在TOP10（Strp R)里筛本身是spec/strp resistant的质粒
至少我同事的情况是假阳性，spec抗性本身可以由单突变引起啊
我这里已经有很多因素需要trouble shooting，所以回避TOP10也算合理吧
如果是已经构建好的Spec质粒，往TOP10里subclone那是另一说
【在 H*******i 的大作中提到】
: 1.建议换酶（PCR不work这个我觉得比试条件有效），相对phusion PCR困难模板个人喜
: 欢Q5，在一些primer靠近terminator的情况，我遇到phusion不work但是Q5（NEB说Q5突
: 变率低，但我觉得Q5似乎突变率高点，不知道是不是错觉）没问题的情况。
: 2.spec单独为什么假阳性，这抗性我经常用，不理解。。。
: 3.comp. cell效率我觉得主要还是和制作方法有关吧，转提纯的质粒做测试得话，我用
: TSS转 MG1655 BW25113 DH10B（TOP10是商品名吧） XL1blue 没有观察到特别显著区别
: （小于一个数量级），当然做克隆或者PCR产物肯定有些区别。 单个人觉得做克隆效率
: 10^7-10^8足够了，更高的效率如果长出来几个，很可能是残留模板之类的。另外胶上
: 看不见确实可以接着做，不过大多情况是费时费力（转化鉴定基本要1.5天），所以我
: 如果觉得PCR完全没东西，基本就换方法了。
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C*******e
发帖数: 4348 | 30 我不是做某个基因的突变
这个subclone，还有sunnyday说的overlapping PCR然后再ligate当然也是可以
另外还有些别的方法绕开
不过都多很多步骤
（在我目前情况下）不是首选
我已经有一批8个同样backbone的质粒，
一个wt，7个mutants，
每一个都是双基因的Dicistronic expression
现在要改变RBS区域的东西
如果QuikChange可行，很快8个就都换好了
不然要从原先的backbone开始折腾起
再重新克隆
虽然我也已经试过用原先没有insert的vector做QuikChange，
也有问题
【在 a*******a 的大作中提到】
: 我都是很挫的subclone到ta载体里做的。慢么是要慢点，不过心情好呀。
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 非常感谢大家的讨论和建议！
有进展我会来报告的！ |
u*********1
发帖数: 2518 | 32 我正好在做这个，8kb的plasmid，用Pfu貌似没问题，PCR出一堆smear，然后digestion
，transformation
但我接着这里也有俩问题：
1. 从板子上挑选不同的colony摇菌，提质粒，测序，发现有的成功引入突变，有的没
有引入突变，有的甚至出现其他地方（不应该出现的）什么deletion之类的。。
这如何解释呢
2. 8kb的target of interest大概是2.5kb；我现在是设计10对引物覆盖这2.5kb，等于
把整个2.5kb都测一下。。。需要这么做吗？因为虽然大家说Pfu很高保真，但我依然害
怕引入其他的乱七八糟的东西，毕竟PCR的产物是一堆smear。。。其实我都好奇这种
long-range PCR到底发生了什么。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
: 以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
: 这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
: 试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
: 是不是8kb太长了？
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C**S
发帖数: 522 | 33 1：没什么解释，就是pcr或者transform的时候突变了。
2：我这儿测序，精确度能到800到1000bp，所以2.5k三个primer就覆盖了。涉及到PCR
的克隆，测序还是需要的，不一定哪里就产生一个突变。
digestion
【在 u*********1 的大作中提到】
: 我正好在做这个，8kb的plasmid，用Pfu貌似没问题，PCR出一堆smear，然后digestion
: ，transformation
: 但我接着这里也有俩问题：
: 1. 从板子上挑选不同的colony摇菌，提质粒，测序，发现有的成功引入突变，有的没
: 有引入突变，有的甚至出现其他地方（不应该出现的）什么deletion之类的。。
: 这如何解释呢
: 2. 8kb的target of interest大概是2.5kb；我现在是设计10对引物覆盖这2.5kb，等于
: 把整个2.5kb都测一下。。。需要这么做吗？因为虽然大家说Pfu很高保真，但我依然害
: 怕引入其他的乱七八糟的东西，毕竟PCR的产物是一堆smear。。。其实我都好奇这种
: long-range PCR到底发生了什么。。。
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H*******i
发帖数: 196 | 34 1.没有突变有两种可能，一种是dpn1处理不完全，第二（某些设计中）如果你的引物5
’可以匹配一段序列，但是3'是突变，那么似乎高保真酶可以把3’切掉，完成PCR，另
外从smear可以看出，你PCR进行得并不好，如果目标片段之中有什么重复序列相似序列
，出现deletion也是很可能的。 我见到smear最多的就是multimer,如果你引物设计如
果做得和cpec最后一步一样，smear可能性非常高
2.pfu按照NEB说法只有6x的保真性，所以肯定要测序（尤其是引物部分，2.5K用不了10
对引物），克隆做多了 phusion Q5突变都是一堆一堆的。
digestion
【在 u*********1 的大作中提到】
: 我正好在做这个，8kb的plasmid，用Pfu貌似没问题，PCR出一堆smear，然后digestion
: ，transformation
: 但我接着这里也有俩问题：
: 1. 从板子上挑选不同的colony摇菌，提质粒，测序，发现有的成功引入突变，有的没
: 有引入突变，有的甚至出现其他地方（不应该出现的）什么deletion之类的。。
: 这如何解释呢
: 2. 8kb的target of interest大概是2.5kb；我现在是设计10对引物覆盖这2.5kb，等于
: 把整个2.5kb都测一下。。。需要这么做吗？因为虽然大家说Pfu很高保真，但我依然害
: 怕引入其他的乱七八糟的东西，毕竟PCR的产物是一堆smear。。。其实我都好奇这种
: long-range PCR到底发生了什么。。。
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m*******u
发帖数: 173 | 35 try some other Taq, like KOD Extreme |
h*******s
发帖数: 327 | 36 我觉得这是正解。
延长到3min/kb以上。
如果还是出不来，换其他方法更快拿到construct为妙。
overlapping
【在 s******y 的大作中提到】
: 是的。比方说3min/kb
: 另外，我常常连条带都看不见也一样能转化，因为Top10 E.coli 实在是太好用了。
: 另外，如果实在搞不出来，就不要和QuikChange 继续肉搏，完全可以换成overlapping
: PCR 来做mutation。
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k****l
发帖数: 279 | 37 可以只P一段，然后酶切，连接
也可以直接合成
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
: 以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
: 这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
: 试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
: 是不是8kb太长了？
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