w********a
发帖数: 324 | 1 大家都在用Gibson Assembly吗？
大家的vector backbone和insert都是切胶纯化的吗？怎么发现切胶后，效率很低，转
到大肠杆菌以后一般很难得到colony。
大家遇到同样的情况吗？有经验的说说。
非常感谢！ |
T**********t
发帖数: 1604 | 2 我都没有切胶纯化。
insert我是PCR之后用DpnI处理降解掉模版，然后用spin column纯化。
vector是酶切linearize了之后直接用。
我转化的效率不算高，但是一般都能拿到想要的colony。 |
w*e
发帖数: 740 | 3 我用了，效果很好呀
一般6个里面就有一个是对的
关键是两端互补的序列一定要准确，你可以增加这个序列的长度，来增加效率
【在 w********a 的大作中提到】
: 大家都在用Gibson Assembly吗？
: 大家的vector backbone和insert都是切胶纯化的吗？怎么发现切胶后，效率很低，转
: 到大肠杆菌以后一般很难得到colony。
: 大家遇到同样的情况吗？有经验的说说。
: 非常感谢！
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w********a
发帖数: 324 | 4 我现在的问题是如果用切胶纯化，转到大肠杆菌以后基本得不到colony； 而如果只是
简单的用PCR cleanup的kit纯化的话，因为insert PCR产物经常有杂带 （而且杂带比
实际的insert要短很多，所以被连上的效率会比insert高很多），分离出来的
construct经常是乱七八糟。
你如果增加互补序列的长度的话，一般增加到多少bp？这样的话，你用切胶纯化也完全
没有问题吗？
另外，进行G.A.反应的时候，你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗？谢谢
【在 w*e 的大作中提到】
: 我用了，效果很好呀
: 一般6个里面就有一个是对的
: 关键是两端互补的序列一定要准确，你可以增加这个序列的长度，来增加效率
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w********a
发帖数: 324 | 5 Vector 酶切linearize了之后， 至少你也做个spin colum纯化吧？还是连这个也省了？
另外，vector如果不是特别长的话，是不是用PCR扩增效果会好些？
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我都没有切胶纯化。
: insert我是PCR之后用DpnI处理降解掉模版，然后用spin column纯化。
: vector是酶切linearize了之后直接用。
: 我转化的效率不算高，但是一般都能拿到想要的colony。
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w*e
发帖数: 740 | 6 我都是切胶纯化PCR产物的，目前还没问题
PCR酶就是他们推荐的Q5类的。
互补序列可以20bp，我都是按照推荐的量加的
谢谢
【在 w********a 的大作中提到】
: 我现在的问题是如果用切胶纯化，转到大肠杆菌以后基本得不到colony； 而如果只是
: 简单的用PCR cleanup的kit纯化的话，因为insert PCR产物经常有杂带 （而且杂带比
: 实际的insert要短很多，所以被连上的效率会比insert高很多），分离出来的
: construct经常是乱七八糟。
: 你如果增加互补序列的长度的话，一般增加到多少bp？这样的话，你用切胶纯化也完全
: 没有问题吗？
: 另外，进行G.A.反应的时候，你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗？谢谢
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s******s
发帖数: 13035 | 7 用的qiagen的gel extractionkit？
这个kit出来的东西很脏，做比较小心的实验，我一般会
再用MinElute过一遍，会浓缩并且干净很多
谢谢
【在 w********a 的大作中提到】
: 我现在的问题是如果用切胶纯化，转到大肠杆菌以后基本得不到colony； 而如果只是
: 简单的用PCR cleanup的kit纯化的话，因为insert PCR产物经常有杂带 （而且杂带比
: 实际的insert要短很多，所以被连上的效率会比insert高很多），分离出来的
: construct经常是乱七八糟。
: 你如果增加互补序列的长度的话，一般增加到多少bp？这样的话，你用切胶纯化也完全
: 没有问题吗？
: 另外，进行G.A.反应的时候，你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗？谢谢
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T**********t
发帖数: 1604 | 8 酶切后的vector我不纯化，直接用。因为需要的量不多，大概100ng左右的vector，然
后同等molar的insert就好了。反正我都会做negative control，酶切过的vector直接
转没有colony。然后转出来的colony也都要测过序才会往下做，基本上没什么大问题。
pick 3个colony的话，至少有两个是对的。
你的问题好像在于insert的PCR出错率太高啊。是模板不纯么？
Gibson需要的vector用量不多，为什么要用PCR扩增？按我上面的用量计算，做一次
miniprep够我做好几百个gibson assembly了。PCR需要加的试剂比酶切要多，而且还要
考虑长PCR出错的概率风险吧。
了？
【在 w********a 的大作中提到】
: Vector 酶切linearize了之后， 至少你也做个spin colum纯化吧？还是连这个也省了？
: 另外，vector如果不是特别长的话，是不是用PCR扩增效果会好些？
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w********a
发帖数: 324 | 9 如果有好几个insert fragments，你是直接跟vector一起G.A？ 还是先把几个
fragments做G.A.，然后拿这个产物做template得到最终的一个整个的insert，然后再
跟vector 做G.A.？
【在 T**********t 的大作中提到】
: 酶切后的vector我不纯化，直接用。因为需要的量不多，大概100ng左右的vector，然
: 后同等molar的insert就好了。反正我都会做negative control，酶切过的vector直接
: 转没有colony。然后转出来的colony也都要测过序才会往下做，基本上没什么大问题。
: pick 3个colony的话，至少有两个是对的。
: 你的问题好像在于insert的PCR出错率太高啊。是模板不纯么？
: Gibson需要的vector用量不多，为什么要用PCR扩增？按我上面的用量计算，做一次
: miniprep够我做好几百个gibson assembly了。PCR需要加的试剂比酶切要多，而且还要
: 考虑长PCR出错的概率风险吧。
:
: 了？
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z*******n
发帖数: 101 | 10 提高浓度，不要按推荐浓度反应，比如10ul反应体系，5ul2x buffer mix ,剩下5ul全
部用vector 和insert 反应两个小时 |
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w********a
发帖数: 324 | 11 是的。一直用Qiagen。
你是说用Qiagen的gel extraction kit纯化了之后，在用MinElute （PCR
purification or gel extraction kit？）再纯化一遍？这样岂不损失更大？
【在 s******s 的大作中提到】
: 用的qiagen的gel extractionkit？
: 这个kit出来的东西很脏，做比较小心的实验，我一般会
: 再用MinElute过一遍，会浓缩并且干净很多
:
: 谢谢
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w********a
发帖数: 324 | 12 那你浓度提高到多少？vector和insert的配比呢？
【在 z*******n 的大作中提到】
: 提高浓度，不要按推荐浓度反应，比如10ul反应体系，5ul2x buffer mix ,剩下5ul全
: 部用vector 和insert 反应两个小时
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s******s
发帖数: 13035 | 13 80%回收率总有的，不差那么点
【在 w********a 的大作中提到】
: 是的。一直用Qiagen。
: 你是说用Qiagen的gel extraction kit纯化了之后，在用MinElute （PCR
: purification or gel extraction kit？）再纯化一遍？这样岂不损失更大？
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s******s
发帖数: 13035 | 14 2+1肯定一起做了，3+1的话也没问题，效率低一点。
4+1没做过。
【在 w********a 的大作中提到】
: 如果有好几个insert fragments，你是直接跟vector一起G.A？ 还是先把几个
: fragments做G.A.，然后拿这个产物做template得到最终的一个整个的insert，然后再
: 跟vector 做G.A.？
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z*******n
发帖数: 101 | 15 看切胶回收的亮度吧, 一般切胶回收也就50-60 ng/ul浓度吧，vector2ul insertion
3ul, 反应完转化Soc recovery时间长点至少2小时。
【在 w********a 的大作中提到】
: 那你浓度提高到多少？vector和insert的配比呢？
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w********a
发帖数: 324 | 16 你说的是G.A.反应两个小时，然后SOC recovery 的时候再两个小时？
【在 z*******n 的大作中提到】
: 看切胶回收的亮度吧, 一般切胶回收也就50-60 ng/ul浓度吧，vector2ul insertion
: 3ul, 反应完转化Soc recovery时间长点至少2小时。
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