w********a 发帖数: 324 | 1 大家都在用Gibson Assembly吗?
大家的vector backbone和insert都是切胶纯化的吗?怎么发现切胶后,效率很低,转
到大肠杆菌以后一般很难得到colony。
大家遇到同样的情况吗?有经验的说说。
非常感谢! |
T**********t 发帖数: 1604 | 2 我都没有切胶纯化。
insert我是PCR之后用DpnI处理降解掉模版,然后用spin column纯化。
vector是酶切linearize了之后直接用。
我转化的效率不算高,但是一般都能拿到想要的colony。 |
w*e 发帖数: 740 | 3 我用了,效果很好呀
一般6个里面就有一个是对的
关键是两端互补的序列一定要准确,你可以增加这个序列的长度,来增加效率
【在 w********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 大家都在用Gibson Assembly吗? : 大家的vector backbone和insert都是切胶纯化的吗?怎么发现切胶后,效率很低,转 : 到大肠杆菌以后一般很难得到colony。 : 大家遇到同样的情况吗?有经验的说说。 : 非常感谢!
|
w********a 发帖数: 324 | 4 我现在的问题是如果用切胶纯化,转到大肠杆菌以后基本得不到colony; 而如果只是
简单的用PCR cleanup的kit纯化的话,因为insert PCR产物经常有杂带 (而且杂带比
实际的insert要短很多,所以被连上的效率会比insert高很多),分离出来的
construct经常是乱七八糟。
你如果增加互补序列的长度的话,一般增加到多少bp?这样的话,你用切胶纯化也完全
没有问题吗?
另外,进行G.A.反应的时候,你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗?谢谢
【在 w*e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我用了,效果很好呀 : 一般6个里面就有一个是对的 : 关键是两端互补的序列一定要准确,你可以增加这个序列的长度,来增加效率
|
w********a 发帖数: 324 | 5 Vector 酶切linearize了之后, 至少你也做个spin colum纯化吧?还是连这个也省了?
另外,vector如果不是特别长的话,是不是用PCR扩增效果会好些?
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我都没有切胶纯化。 : insert我是PCR之后用DpnI处理降解掉模版,然后用spin column纯化。 : vector是酶切linearize了之后直接用。 : 我转化的效率不算高,但是一般都能拿到想要的colony。
|
w*e 发帖数: 740 | 6 我都是切胶纯化PCR产物的,目前还没问题
PCR酶就是他们推荐的Q5类的。
互补序列可以20bp,我都是按照推荐的量加的
谢谢
【在 w********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我现在的问题是如果用切胶纯化,转到大肠杆菌以后基本得不到colony; 而如果只是 : 简单的用PCR cleanup的kit纯化的话,因为insert PCR产物经常有杂带 (而且杂带比 : 实际的insert要短很多,所以被连上的效率会比insert高很多),分离出来的 : construct经常是乱七八糟。 : 你如果增加互补序列的长度的话,一般增加到多少bp?这样的话,你用切胶纯化也完全 : 没有问题吗? : 另外,进行G.A.反应的时候,你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗?谢谢
|
s******s 发帖数: 13035 | 7 用的qiagen的gel extractionkit?
这个kit出来的东西很脏,做比较小心的实验,我一般会
再用MinElute过一遍,会浓缩并且干净很多
谢谢
【在 w********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我现在的问题是如果用切胶纯化,转到大肠杆菌以后基本得不到colony; 而如果只是 : 简单的用PCR cleanup的kit纯化的话,因为insert PCR产物经常有杂带 (而且杂带比 : 实际的insert要短很多,所以被连上的效率会比insert高很多),分离出来的 : construct经常是乱七八糟。 : 你如果增加互补序列的长度的话,一般增加到多少bp?这样的话,你用切胶纯化也完全 : 没有问题吗? : 另外,进行G.A.反应的时候,你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗?谢谢
|
T**********t 发帖数: 1604 | 8 酶切后的vector我不纯化,直接用。因为需要的量不多,大概100ng左右的vector,然
后同等molar的insert就好了。反正我都会做negative control,酶切过的vector直接
转没有colony。然后转出来的colony也都要测过序才会往下做,基本上没什么大问题。
pick 3个colony的话,至少有两个是对的。
你的问题好像在于insert的PCR出错率太高啊。是模板不纯么?
Gibson需要的vector用量不多,为什么要用PCR扩增?按我上面的用量计算,做一次
miniprep够我做好几百个gibson assembly了。PCR需要加的试剂比酶切要多,而且还要
考虑长PCR出错的概率风险吧。
了?
【在 w********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Vector 酶切linearize了之后, 至少你也做个spin colum纯化吧?还是连这个也省了? : 另外,vector如果不是特别长的话,是不是用PCR扩增效果会好些?
|
w********a 发帖数: 324 | 9 如果有好几个insert fragments,你是直接跟vector一起G.A? 还是先把几个
fragments做G.A.,然后拿这个产物做template得到最终的一个整个的insert,然后再
跟vector 做G.A.?
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 酶切后的vector我不纯化,直接用。因为需要的量不多,大概100ng左右的vector,然 : 后同等molar的insert就好了。反正我都会做negative control,酶切过的vector直接 : 转没有colony。然后转出来的colony也都要测过序才会往下做,基本上没什么大问题。 : pick 3个colony的话,至少有两个是对的。 : 你的问题好像在于insert的PCR出错率太高啊。是模板不纯么? : Gibson需要的vector用量不多,为什么要用PCR扩增?按我上面的用量计算,做一次 : miniprep够我做好几百个gibson assembly了。PCR需要加的试剂比酶切要多,而且还要 : 考虑长PCR出错的概率风险吧。 : : 了?
|
z*******n 发帖数: 101 | 10 提高浓度,不要按推荐浓度反应,比如10ul反应体系,5ul2x buffer mix ,剩下5ul全
部用vector 和insert 反应两个小时 |
|
|
w********a 发帖数: 324 | 11 是的。一直用Qiagen。
你是说用Qiagen的gel extraction kit纯化了之后,在用MinElute (PCR
purification or gel extraction kit?)再纯化一遍?这样岂不损失更大?
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用的qiagen的gel extractionkit? : 这个kit出来的东西很脏,做比较小心的实验,我一般会 : 再用MinElute过一遍,会浓缩并且干净很多 : : 谢谢
|
w********a 发帖数: 324 | 12 那你浓度提高到多少?vector和insert的配比呢?
【在 z*******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 提高浓度,不要按推荐浓度反应,比如10ul反应体系,5ul2x buffer mix ,剩下5ul全 : 部用vector 和insert 反应两个小时
|
s******s 发帖数: 13035 | 13 80%回收率总有的,不差那么点
【在 w********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 是的。一直用Qiagen。 : 你是说用Qiagen的gel extraction kit纯化了之后,在用MinElute (PCR : purification or gel extraction kit?)再纯化一遍?这样岂不损失更大?
|
s******s 发帖数: 13035 | 14 2+1肯定一起做了,3+1的话也没问题,效率低一点。
4+1没做过。
【在 w********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果有好几个insert fragments,你是直接跟vector一起G.A? 还是先把几个 : fragments做G.A.,然后拿这个产物做template得到最终的一个整个的insert,然后再 : 跟vector 做G.A.?
|
z*******n 发帖数: 101 | 15 看切胶回收的亮度吧, 一般切胶回收也就50-60 ng/ul浓度吧,vector2ul insertion
3ul, 反应完转化Soc recovery时间长点至少2小时。
【在 w********a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那你浓度提高到多少?vector和insert的配比呢?
|
w********a 发帖数: 324 | 16 你说的是G.A.反应两个小时,然后SOC recovery 的时候再两个小时?
【在 z*******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 看切胶回收的亮度吧, 一般切胶回收也就50-60 ng/ul浓度吧,vector2ul insertion : 3ul, 反应完转化Soc recovery时间长点至少2小时。
|