E*****e
发帖数: 54 | 1 就是一般的质粒如pEGFP－N1， 转到Hela或者293T里
还有一个问题是，质粒会随细胞分裂而复制吗？ 谢谢 |
Z******5
发帖数: 435 | 2 质粒好像没有真核复制起始位点吧？应该不能复制。
Histone deposition我也一直很好奇，不知道哪里有这方面的信息。
另外一个问题就是进入细胞的质粒的量的问题。我们普通做瞬转，如果假定转染效率是
100%，那么进入单个细胞的质粒数目大概能达到上亿的数量级。这是很夸张的一件事，
除非转染效率低得离谱。 |
s******y
发帖数: 28562 | 3 按照我的理解，质粒大部分时间都是在细胞质里漂着的，接触到组蛋白的机会很少。特
别是，组蛋白包装的时期是S期。那个时候核膜还是完整的，质粒没有太大的机会进入
核内部，所以包不起来。
至于复制，另外一个同学已经讲了，大部分质粒缺乏真核的复制起点。唯一的特例就是
被病毒感染过的细胞（比方说293T），这个含有病毒的复制因子所以可以小规模的复制
含有SV40 复制起点的质粒。
【在 E*****e 的大作中提到】
: 就是一般的质粒如pEGFP－N1， 转到Hela或者293T里
: 还有一个问题是，质粒会随细胞分裂而复制吗？ 谢谢
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T****u
发帖数: 424 | 4 我很负责地告诉你，是有nucleosome的
很久很久之前，我做的一个实验就是把质粒转进，再提出来，能看到漂亮的nucleosome
packing.
【在 E*****e 的大作中提到】
: 就是一般的质粒如pEGFP－N1， 转到Hela或者293T里
: 还有一个问题是，质粒会随细胞分裂而复制吗？ 谢谢
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s******y
发帖数: 28562 | 5 有点不太明白的问一下，是用普通的环状质粒，lipid-based 方法转进去的，还是用切
断过的线状碎片，用电转进去的？如果用环状，也能包装么？
nucleosome
【在 T****u 的大作中提到】
: 我很负责地告诉你，是有nucleosome的
: 很久很久之前，我做的一个实验就是把质粒转进，再提出来，能看到漂亮的nucleosome
: packing.
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s******r
发帖数: 1245 | 6 质粒不进核怎么转录出mRNA表达外源基因？
【在 s******y 的大作中提到】
: 按照我的理解，质粒大部分时间都是在细胞质里漂着的，接触到组蛋白的机会很少。特
: 别是，组蛋白包装的时期是S期。那个时候核膜还是完整的，质粒没有太大的机会进入
: 核内部，所以包不起来。
: 至于复制，另外一个同学已经讲了，大部分质粒缺乏真核的复制起点。唯一的特例就是
: 被病毒感染过的细胞（比方说293T），这个含有病毒的复制因子所以可以小规模的复制
: 含有SV40 复制起点的质粒。
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j****x
发帖数: 1704 | 7 这里我倒是还知道一个“唯二”的特例：
如果在哺乳动物表达质粒的转录单位后面接上一段nuclear scaffold matrix
attached region（SMAR序列），那么该质粒就可以在不需要真核复制起始位点的情况
下以episome的形式存在并跟随基因组染色体在细胞分裂的过程中自我复制无需任何其
他条件。这种情况下的组蛋白的结合和修饰都是存在的，但有其特殊性。
【在 s******y 的大作中提到】
: 有点不太明白的问一下，是用普通的环状质粒，lipid-based 方法转进去的，还是用切
: 断过的线状碎片，用电转进去的？如果用环状，也能包装么？
:
: nucleosome
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H**O
发帖数: 89 | 8 同想知道
【在 s******r 的大作中提到】
: 质粒不进核怎么转录出mRNA表达外源基因？
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c********b
发帖数: 363 | 9 起码在植物里不是这样。
不能进细胞核的质粒很难表达，因为很难接触转录酶系。植物病毒的DNA（和环状质粒
差不多）有时会进细胞核并被histone包裹
【在 s******y 的大作中提到】
: 按照我的理解，质粒大部分时间都是在细胞质里漂着的，接触到组蛋白的机会很少。特
: 别是，组蛋白包装的时期是S期。那个时候核膜还是完整的，质粒没有太大的机会进入
: 核内部，所以包不起来。
: 至于复制，另外一个同学已经讲了，大部分质粒缺乏真核的复制起点。唯一的特例就是
: 被病毒感染过的细胞（比方说293T），这个含有病毒的复制因子所以可以小规模的复制
: 含有SV40 复制起点的质粒。
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c********b
发帖数: 363 | 10 环状质粒进入植物细胞核是通过importin4 alpha介导的，这是已知的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 有点不太明白的问一下，是用普通的环状质粒，lipid-based 方法转进去的，还是用切
: 断过的线状碎片，用电转进去的？如果用环状，也能包装么？
:
: nucleosome
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j****x
发帖数: 1704 | 11 大于300bp的质粒入核需要跨越核膜的屏障，简单说来，可能存在2种“常见”机制，尽
管实际情况会复杂的多。
1. 对于dividing cells，细胞分裂过程中核膜解体，质粒得以进入核内，这属于“
passive nuclear importation”，没什么疑问。
2. 对于non-dividing cells，NPC介导的active transport则是可能的主要途径。这其
中plasmid上面的sequence-specific element以及某些host facotor都是必要的条件。
这一块的具体机制似乎还不是完全清楚，但有证据表明，这一途径存在明显的sequence
-dependent以及transcription-dependent的特性。 |
h***l
发帖数: 168 | 12 This is relevant -- Howard Cedar papers -
plasmids injected to nuclei are differentially packaged during early vs.
late S-phase. |
s******y
发帖数: 28562 | 13 大部分质粒，其实都是要等细胞分裂的时候趁机进入核的。
所以大部分质粒转录需要细胞有分裂过程。如果细胞根本不分裂，那么质粒上的蛋白就
基本上没有办法表达。
某些病毒的DNA除外, 他们有办法在非分裂期进入核。
【在 s******r 的大作中提到】
: 质粒不进核怎么转录出mRNA表达外源基因？
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s******y
发帖数: 28562 | 14 如果不是注射进去的呢？比方说一般转录进去的会怎么样？
我对这个方面挺好奇的。
【在 h***l 的大作中提到】
: This is relevant -- Howard Cedar papers -
: plasmids injected to nuclei are differentially packaged during early vs.
: late S-phase.
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O******e
发帖数: 4845 | 15 质粒肯定是要进核的，否则转录如何完成？你想想，我们用的过表达的载体，是必需经过
转录这一步的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 按照我的理解，质粒大部分时间都是在细胞质里漂着的，接触到组蛋白的机会很少。特
: 别是，组蛋白包装的时期是S期。那个时候核膜还是完整的，质粒没有太大的机会进入
: 核内部，所以包不起来。
: 至于复制，另外一个同学已经讲了，大部分质粒缺乏真核的复制起点。唯一的特例就是
: 被病毒感染过的细胞（比方说293T），这个含有病毒的复制因子所以可以小规模的复制
: 含有SV40 复制起点的质粒。
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O******e
发帖数: 4845 | 16 你说趁机入核，也就是随机被细胞核包括进去？这个跟我理解的通过nuclear pore进核
出入挺大的。有什么依据么？补补课。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 大部分质粒，其实都是要等细胞分裂的时候趁机进入核的。
: 所以大部分质粒转录需要细胞有分裂过程。如果细胞根本不分裂，那么质粒上的蛋白就
: 基本上没有办法表达。
: 某些病毒的DNA除外, 他们有办法在非分裂期进入核。
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m******5
发帖数: 1383 | 17 弱弱地说一下，我记得plasmid进核基本是一定的，除了植物里importin alpha介导有
人已经说了，哺乳动物细胞是由importin T介导的（STH like that）
另外，我觉得可以做几个thought experiment
1,如果只有M phase plasmid才能趁着核膜解体进核，那酵母里转染基本是mission
impossible了（因为酵母核膜不解体）。
2，如果只有M phase plasmid才能进核，我们转染293T是不可能在24小时后达到80%的
transfection efficiency without doubled cell number.
3,如果M phase plasmid才能进核，是否表达外源质粒早就会被发展成鉴定是否post -
mitotic cell的标准了。
…………我觉得还有很多例子。
最后弱弱地说一下，我之所以想到这些粒子，因为我似乎看到过把质粒转进去再pull
down下来看sequence specific histon deposition的，啊哈哈 |
j****x
发帖数: 1704 | 18 plasmid在非分裂期通过NPC入核当然是可能的，但是需要特定的DNA序列支持，比如
SV40 ori或者NLS bingding sequence的存在，importin介导的质粒入核不是无条件的
，这点已经非常明确了。真核表达质粒往往都会包含这些sequence element,所以会让
人产生错觉，觉得是理所应当的，其实不然。
-
【在 m******5 的大作中提到】
: 弱弱地说一下，我记得plasmid进核基本是一定的，除了植物里importin alpha介导有
: 人已经说了，哺乳动物细胞是由importin T介导的（STH like that）
: 另外，我觉得可以做几个thought experiment
: 1,如果只有M phase plasmid才能趁着核膜解体进核，那酵母里转染基本是mission
: impossible了（因为酵母核膜不解体）。
: 2，如果只有M phase plasmid才能进核，我们转染293T是不可能在24小时后达到80%的
: transfection efficiency without doubled cell number.
: 3,如果M phase plasmid才能进核，是否表达外源质粒早就会被发展成鉴定是否post -
: mitotic cell的标准了。
: …………我觉得还有很多例子。
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m******5
发帖数: 1383 | 19 Thanks!!! I had no idea
【在 j****x 的大作中提到】
: plasmid在非分裂期通过NPC入核当然是可能的，但是需要特定的DNA序列支持，比如
: SV40 ori或者NLS bingding sequence的存在，importin介导的质粒入核不是无条件的
: ，这点已经非常明确了。真核表达质粒往往都会包含这些sequence element,所以会让
: 人产生错觉，觉得是理所应当的，其实不然。
:
: -
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s********x
发帖数: 472 | 20 一些virus的dna 序列是帮助质粒入核的. 但是有没有人知道是那段序列？比如常见的
pcdna系列vector. |
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j******i
发帖数: 939 | 21 你确定有这样的dna序列? 我知道，hiv可以感染不分裂的细胞，因为能形成dna-
protein复合体，帮助进入细胞核。单独的一段dna序列恐怕不够吧？
蛋白进入细胞核倒是只要加NLS序列就好。
另外，plasmid用transfection 还是nucleofection 入核机理是不同的。后者，跟细胞
骨架有关。前者，一般认为是随细胞分裂人核的。
【在 s********x 的大作中提到】
: 一些virus的dna 序列是帮助质粒入核的. 但是有没有人知道是那段序列？比如常见的
: pcdna系列vector.
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j****x
发帖数: 1704 | 22 前面提到过几次了，质粒上带有的SV40 ori就可以介导入核，或者带有NLS binding
seq也可以。
外事不决问google
【在 j******i 的大作中提到】
: 你确定有这样的dna序列? 我知道，hiv可以感染不分裂的细胞，因为能形成dna-
: protein复合体，帮助进入细胞核。单独的一段dna序列恐怕不够吧？
: 蛋白进入细胞核倒是只要加NLS序列就好。
: 另外，plasmid用transfection 还是nucleofection 入核机理是不同的。后者，跟细胞
: 骨架有关。前者，一般认为是随细胞分裂人核的。
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j******i
发帖数: 939 | 23 google一下，确实是有。很奇怪，有人在做这些。另外一些，却做相反的事情－把多余
的序列都去掉，只留下expression cassette 来产生minicircle DNA, 表达效果却比普
通的plasmid好很多。
【在 j****x 的大作中提到】
: 前面提到过几次了，质粒上带有的SV40 ori就可以介导入核，或者带有NLS binding
: seq也可以。
: 外事不决问google
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j****x
发帖数: 1704 | 24 在非分裂细胞的上效果未必会那么好了
也有研究表明，转录活跃的质粒更容易入核，如果抑制转录，则入核效率极大降低。提
示DNA和转录因子的结合可能在入核过程中有重要的作用。
不过这一块好像没什么系统性的研究，到现在也还是半清不楚的
【在 j******i 的大作中提到】
: google一下，确实是有。很奇怪，有人在做这些。另外一些，却做相反的事情－把多余
: 的序列都去掉，只留下expression cassette 来产生minicircle DNA, 表达效果却比普
: 通的plasmid好很多。
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j******i
发帖数: 939 | 25 SBI关于他家minicircle DNA描述：
'For dividing cells, expression of the minicircles lasts up to 14 days. For
non-dividing cells, expression of the minicircles drops slightly after the
first week, but then can continue expressing the transgenes for months.'
可能入核跟size也有关系。minicircle DNA小，更容易进入细胞核。
【在 j****x 的大作中提到】
: 在非分裂细胞的上效果未必会那么好了
: 也有研究表明，转录活跃的质粒更容易入核，如果抑制转录，则入核效率极大降低。提
: 示DNA和转录因子的结合可能在入核过程中有重要的作用。
: 不过这一块好像没什么系统性的研究，到现在也还是半清不楚的
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b********g
发帖数: 46 | 26
nucleosome
请问，如何把这种质粒提取出来的？用什么方法看到nucleosome packing ?
【在 T****u 的大作中提到】
: 我很负责地告诉你，是有nucleosome的
: 很久很久之前，我做的一个实验就是把质粒转进，再提出来，能看到漂亮的nucleosome
: packing.
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g*********5
发帖数: 2533 | 27 为什么这个能表达14天？这不是意味着我不用作稳定转染了？
For
【在 j******i 的大作中提到】
: SBI关于他家minicircle DNA描述：
: 'For dividing cells, expression of the minicircles lasts up to 14 days. For
: non-dividing cells, expression of the minicircles drops slightly after the
: first week, but then can continue expressing the transgenes for months.'
: 可能入核跟size也有关系。minicircle DNA小，更容易进入细胞核。
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d*******3
发帖数: 8598 | 28 额。
nucleosome
【在 T****u 的大作中提到】
: 我很负责地告诉你，是有nucleosome的
: 很久很久之前，我做的一个实验就是把质粒转进，再提出来，能看到漂亮的nucleosome
: packing.
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d*******3
发帖数: 8598 | 29 额。
【在 j****x 的大作中提到】
: 这里我倒是还知道一个“唯二”的特例：
: 如果在哺乳动物表达质粒的转录单位后面接上一段nuclear scaffold matrix
: attached region（SMAR序列），那么该质粒就可以在不需要真核复制起始位点的情况
: 下以episome的形式存在并跟随基因组染色体在细胞分裂的过程中自我复制无需任何其
: 他条件。这种情况下的组蛋白的结合和修饰都是存在的，但有其特殊性。
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