a******a
发帖数: 283 | 1 有个问题需要大牛的智慧。
两个病毒载体，一个是商业卖的做浓度标准曲线（用A序列的primers来测定）；一个是
自己构建的。主要骨架一样，只是我们自己做的除了有A序列之外，还有自己的靶基因B
序列。因此自己构建的载体，除了可以用A序列的primers之外，还可以用B序列的
primers来测浓度。
唯一的问题就是，B序列的测定因为GC成分高，所以primers反应浓度要高于A序列
primers的浓度。
作出来的标准曲线（同一个96孔板），用B序列的primers做的，Ct values要比用A序列
的primers迟上5-6个Ct。作出来的曲线，efficiency （都在90%-100%之间）和R
square（都在0.99以上）都类似。
但是作出来的EQUATION在Y-axis上的截距就不一样，差了有6的样子。这样用B作出来
的equation计算出来的样品浓度就比用A作出来的equation计算出来的样品浓度要高10
倍。
有什么看法吗？
这个B序列的primers反应浓度已经高得太离奇了，2um final concentration，低了就
更加出不了什么好的标准曲线了。针对B序列，这个primers已经是我们设计找到的最好
的primers了，因为这个序列的特殊性。
挠脑袋中。。。 |
y****i
发帖数: 2194 | 2 你自己重新设计一个高GC低效率的A primer跟B match上不就好了
因B
【在 a******a 的大作中提到】
: 有个问题需要大牛的智慧。
: 两个病毒载体，一个是商业卖的做浓度标准曲线（用A序列的primers来测定）；一个是
: 自己构建的。主要骨架一样，只是我们自己做的除了有A序列之外，还有自己的靶基因B
: 序列。因此自己构建的载体，除了可以用A序列的primers之外，还可以用B序列的
: primers来测浓度。
: 唯一的问题就是，B序列的测定因为GC成分高，所以primers反应浓度要高于A序列
: primers的浓度。
: 作出来的标准曲线（同一个96孔板），用B序列的primers做的，Ct values要比用A序列
: 的primers迟上5-6个Ct。作出来的曲线，efficiency （都在90%-100%之间）和R
: square（都在0.99以上）都类似。
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a******a
发帖数: 283 | 3 这个是一种方案。另外一种方案是，我们也可以建造一个更全面的B载体浓度梯度监测
数据，选择这些数据来建立一个标准曲线。可以选不同的primers浓度来测试，优化曲
线。
问题是这个标准曲线右移和左移，样品浓度差了那么大，从数学意义上来说，怎么理解
好呢？我数学比较差，估计得想好几天。一下子想不出来。
【在 y****i 的大作中提到】
: 你自己重新设计一个高GC低效率的A primer跟B match上不就好了
:
: 因B
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n********e
发帖数: 1630 | 4 qPCRd 的数据都是跟对照比较吧。。。直接用来quantification 绝对copy数很难吧。
。为什么不直接有B的plsamid扩增标准曲线 |
a******a
发帖数: 283 | 5 有的。
不过问题解决了，是我使用了一个错误的起始浓度来计算。现在问题解决了，都很符合
。两个标准曲线是重叠的。嘻嘻。
昨天回家路上挠脑袋，睡前刷牙的时候一下子就想到了。
【在 n********e 的大作中提到】
: qPCRd 的数据都是跟对照比较吧。。。直接用来quantification 绝对copy数很难吧。
: 。为什么不直接有B的plsamid扩增标准曲线
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D********0
发帖数: 409 | |
D*a
发帖数: 6830 | |
