i*********0 发帖数: 915 | 1 最近有发现一个现象。mESCs,用一个gene 的shRNA 处理以后,通过RNA-seq, 发现整
个X 染色体上的gene 都被silence了 (程度不一,但是都在shRNA treated ESCs
samples,都有2-8倍数的reduction)。 这种现象说明了什么?
有没有做X染色体transcription牛牛来说说看? |
t******k 发帖数: 5617 | |
l*******i 发帖数: 153 | 3 有意思。
是female mESC吗?是的话,先做两个实验:
1)H3K27me3 immunostaing:可能发现small dot in nucleus.
2)qRT-PCR测Xist的表达,或者用FISH。
证实的话,就说明出现X chormosome inactivation了。
几个问题:
3) mESC的培养条件?serum,还是2i/LIF?
1)knockdown的mESC是否仍保持未分化状态,还是开始分化了?如果未分化,那么很有
可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子,做深了,至少是
cell stem cell.如果细胞分化了,那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪,有多
大新意取决于你的这个gene
2)看一下这个基因的功能,是否已有先关报道,与X chromosome reactivation有关。
是histone modifier, TF还是在X chromsome上的新lncRNA? |
i*********0 发帖数: 915 | 4 我明天确认一下是不是female 的ESCs。
对于其他的问题:
几个问题:
3) mESC的培养条件?serum,还是2i/LIF?
serum + LIF的培养条件
1)knockdown的mESC是否仍保持未分化状态,还是开始分化了?如果未分化,那么很有
可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子,做深了,至少是
cell stem cell.如果细胞分化了,那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪,有多
大新意取决于你的这个gene
如果要看Oct4等gene的表达的话,RNA 水平上看到降低,Protein水平上有20%左右的降
低。但是这些pluripotency的gene在蛋白水平还维持在一个高的状态。
2)看一下这个基因的功能,是否已有先关报道,与X chromosome reactivation有关。
是histone modifier, TF还是在X chromsome上的新lncRNA?
该gene目前的功能还不清楚。另外,我看到Xist gene在shRNA处理想样品中,在RNA水
平上有3倍数的降低。
【在 l*******i 的大作中提到】 : 有意思。 : 是female mESC吗?是的话,先做两个实验: : 1)H3K27me3 immunostaing:可能发现small dot in nucleus. : 2)qRT-PCR测Xist的表达,或者用FISH。 : 证实的话,就说明出现X chormosome inactivation了。 : 几个问题: : 3) mESC的培养条件?serum,还是2i/LIF? : 1)knockdown的mESC是否仍保持未分化状态,还是开始分化了?如果未分化,那么很有 : 可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子,做深了,至少是 : cell stem cell.如果细胞分化了,那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪,有多
|
l*******i 发帖数: 153 | 5 Xist下调是RNA-seq的结果,还是qPCR结果?这一点比较奇怪,与X chromosome
inactivation不一致。
按理说,在mESC中,X chromosome是active的,即XaXa,Xist应该不表达才对。Xist表
达时,会把其中一条X chromosome“包裹”起来,这条chromosome进而失活。X
inactivation一般指发生在female mEpiSC与分化的细胞中.
你这个结果与理论相反,X chromosome基因下调时,Xist竟然也降低。Xist在对照和
knockdown细胞中的表达分别是多少(RPKM or CT value)?
另一个问题,由于你用的培养条件是serum+LIF,这会导致heterogeneity.建议你用2i/
LIF.
knockdown mESC分化明显吗? colony morphology改变如何,还是依旧维持与WT一样的
形态?
如果你确定用的是female mESCs的话,建议先做H3K27me3 staining,看看X chromosome
是不是失活的。
【在 i*********0 的大作中提到】 : 我明天确认一下是不是female 的ESCs。 : 对于其他的问题: : 几个问题: : 3) mESC的培养条件?serum,还是2i/LIF? : serum + LIF的培养条件 : 1)knockdown的mESC是否仍保持未分化状态,还是开始分化了?如果未分化,那么很有 : 可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子,做深了,至少是 : cell stem cell.如果细胞分化了,那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪,有多 : 大新意取决于你的这个gene : 如果要看Oct4等gene的表达的话,RNA 水平上看到降低,Protein水平上有20%左右的降
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i*********0 发帖数: 915 | 6
是RNA-seq的结果。我也觉得很奇怪,
这一点比较奇怪,与X chromosome
Xist在对照和
这个我要去问一下我们的搞生物信息学的。
ok!
分化不明显。
colony morphology改变如何,还是依旧维持与WT一样的
colony looks like the control shRNA clone。 shiny and clear boundary
【在 l*******i 的大作中提到】 : Xist下调是RNA-seq的结果,还是qPCR结果?这一点比较奇怪,与X chromosome : inactivation不一致。 : 按理说,在mESC中,X chromosome是active的,即XaXa,Xist应该不表达才对。Xist表 : 达时,会把其中一条X chromosome“包裹”起来,这条chromosome进而失活。X : inactivation一般指发生在female mEpiSC与分化的细胞中. : 你这个结果与理论相反,X chromosome基因下调时,Xist竟然也降低。Xist在对照和 : knockdown细胞中的表达分别是多少(RPKM or CT value)? : 另一个问题,由于你用的培养条件是serum+LIF,这会导致heterogeneity.建议你用2i/ : LIF. : knockdown mESC分化明显吗? colony morphology改变如何,还是依旧维持与WT一样的
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o**i 发帖数: 1165 | 7 5 楼说得对.mESC XaXa的
我记得naive的mESC是 XaXa的到了primed阶段就变成了XaXi,自然X上的gene有差别.我
忘记这两者之间有哪个gene的变化了.但colony形态上会有差别.
我猜可能你哪个基因跟维持mESC 的naive状态相关. |
o**i 发帖数: 1165 | 8 我觉得肯定是female的啊,不用看了.
如果是male的细胞.人家本来就一个x 您还给knockdown了 还让不让细胞活了.细胞没Y
活的好好的,没X死翘翘啊. |
s******r 发帖数: 1245 | 9 你的RNAseq是strand specific的?
不是的话应该没法区分xist和tsix因为它俩有一部分互为antisense,需要做specific
region的qPCR来验证是哪个的变化,可能降低的是tsix那是会激活xi的
【在 i*********0 的大作中提到】 : : 是RNA-seq的结果。我也觉得很奇怪, : 这一点比较奇怪,与X chromosome : Xist在对照和 : 这个我要去问一下我们的搞生物信息学的。 : ok! : 分化不明显。 : colony morphology改变如何,还是依旧维持与WT一样的 : colony looks like the control shRNA clone。 shiny and clear boundary
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i*********0 发帖数: 915 | 10 谢谢大家的comment。我再读一下paper,好好的消化一下,再和大家讨论。 |