w*****a 发帖数: 437 | 1 刚接触Lentivirus,啥都不懂,求大拿指点。
是这样,老板想看一个基因A在Smooth muscle cell differentiation里面的作用。手
上有个神经干细胞的cell line,加Tgfb后5-6天会变成SMC。
然后有前人留下来的overexpression A的lentivirus,和knockdown A的ShRNA
lentivirus,冻在-80,都大概有10多管15ml的virus。
老板想用virus overexpress 或 knockdown 基因A, 然后看differentiation pattern
有啥变化。可能用qPCR,RNA-seq啥的做readout。
本来想随便测个titer,把现有的virus加1ml到正differentiate的细胞里面(24 well)
,然后提个RNA就得了。后来一想,问题来了:
1)这神经干细胞特金贵,要特殊的medium养才成,我这virus supernatant加进去搞个
几天,还能活吗?更不提按正常程序differentiate了。那做出来的东西,不是非常的
artificial么?
2)要细胞长得好是不是得做inducible 的stable line,只需用doxycycline加在medium
里就行了。但做这个估计得1-2个月吧。
啰啰嗦嗦,其实就是怎么加virus会比较不影响细胞正常生长分化,又保证
transduction效率。。
谢谢~ |
m****e 发帖数: 173 | 2 lenti -80放多久了,超过两三个月,建议你重做一批。
你担心virus体积太大, 下次自己做的时候用超速离心机离下来,一个T75做的virus用
100ul MEM重悬,一个24 well加10ul virus足矣。 |
w*****a 发帖数: 437 | 3 谢谢!超速离心是个好办法,一般要多快离多久啊。
估计差不多2-3个月了,重做是要从养293和加各式各样的plasmid开始是吧?那不是得
好一阵子养了。。
一个双黄包聊表谢意~
【在 m****e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : lenti -80放多久了,超过两三个月,建议你重做一批。 : 你担心virus体积太大, 下次自己做的时候用超速离心机离下来,一个T75做的virus用 : 100ul MEM重悬,一个24 well加10ul virus足矣。
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a*******a 发帖数: 4233 | 4 可能需要浓缩然后换被感染细胞的培养基重悬
不然stem cell可能会分化
pattern
well)
【在 w*****a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 刚接触Lentivirus,啥都不懂,求大拿指点。 : 是这样,老板想看一个基因A在Smooth muscle cell differentiation里面的作用。手 : 上有个神经干细胞的cell line,加Tgfb后5-6天会变成SMC。 : 然后有前人留下来的overexpression A的lentivirus,和knockdown A的ShRNA : lentivirus,冻在-80,都大概有10多管15ml的virus。 : 老板想用virus overexpress 或 knockdown 基因A, 然后看differentiation pattern : 有啥变化。可能用qPCR,RNA-seq啥的做readout。 : 本来想随便测个titer,把现有的virus加1ml到正differentiate的细胞里面(24 well) : ,然后提个RNA就得了。后来一想,问题来了: : 1)这神经干细胞特金贵,要特殊的medium养才成,我这virus supernatant加进去搞个
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d*****r 发帖数: 45 | 5 浓缩病毒可以用 PEG Virus Precipitation Kit,损失更小些
293T准备好了以后,做完transfection两三天就可以收病毒了,不用太久
【在 w*****a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢!超速离心是个好办法,一般要多快离多久啊。 : 估计差不多2-3个月了,重做是要从养293和加各式各样的plasmid开始是吧?那不是得 : 好一阵子养了。。 : 一个双黄包聊表谢意~
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m****e 发帖数: 173 | 6 49,000 x g for 90 min
拿到hek,周一分细胞,周二transfection,周四离心,周五分装。然后就可以用了
【在 w*****a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢!超速离心是个好办法,一般要多快离多久啊。 : 估计差不多2-3个月了,重做是要从养293和加各式各样的plasmid开始是吧?那不是得 : 好一阵子养了。。 : 一个双黄包聊表谢意~
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w*****a 发帖数: 437 | 7 谢谢楼上各位的回复!每人一个小笼包鼓励:-)
看来大家都觉得要重新做virus,那是不是要买lentiviral packaging kit来包装?哪
家的比较好用啊~
-80的virus,是不是可以浓缩以后试试,clontech有个浓缩病毒的kit不知好用不? |
j****x 发帖数: 1704 | 8 更简单的办法是超滤浓缩,millipore的100K Ultra Centrifugal Filter,可以直接浓
缩100-200倍。
4质粒共转染293T/293FT细胞,隔天换液,3天后收上清,然后超滤浓缩,浓缩后的病毒
直接感染靶细胞,效果会比冻融之后的好几倍到一个数量级。
【在 w*****a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢!超速离心是个好办法,一般要多快离多久啊。 : 估计差不多2-3个月了,重做是要从养293和加各式各样的plasmid开始是吧?那不是得 : 好一阵子养了。。 : 一个双黄包聊表谢意~
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w*****a 发帖数: 437 | 9 谢谢!
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 更简单的办法是超滤浓缩,millipore的100K Ultra Centrifugal Filter,可以直接浓 : 缩100-200倍。 : 4质粒共转染293T/293FT细胞,隔天换液,3天后收上清,然后超滤浓缩,浓缩后的病毒 : 直接感染靶细胞,效果会比冻融之后的好几倍到一个数量级。
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f*******a 发帖数: 671 | 10 我们都放了好几年的还用呢。不过要重新做titer
【在 m****e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : lenti -80放多久了,超过两三个月,建议你重做一批。 : 你担心virus体积太大, 下次自己做的时候用超速离心机离下来,一个T75做的virus用 : 100ul MEM重悬,一个24 well加10ul virus足矣。
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w*****a 发帖数: 437 | 11 谢谢!请问用哪个titer kit做titer啊?
【在 f*******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们都放了好几年的还用呢。不过要重新做titer
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