g*********3
发帖数: 177 | 1 Hi All,
Recently I am doing CHIP-QPCR to test one TF binding. I use 10% of sample as
Input and the rest 90% to do IP. I have the TF-positive cell line A and TF-
depleted cell line B.
Primer is flanking the targeting site of TF.
The result I have is:
In A: Ct in IP 26 & Ct in Input 20 [Ct difference is 4]
In B: Ct in IP 30 & Ct in Input 20. [Ct difference is 10]
It seems TF binds to the targeting site.
However, I followed the calculation process of other people to estimate
yield:
1/9*1/(2^6)
which is extremely low.
I am wondering if anybody has some idea about this: is it reasonable to do
calculation like this? what is the average yield you get?
Thanks. |
g*********3
发帖数: 177 | |
t**l
发帖数: 109 | 3 我也在自己做CHIP
我感觉你的INPUT太多了。 你说你的SAMPLE A 的CT diff is 4. 明明是6。
不知道你是不是抄错了，然后你按6算的？ |
t**l
发帖数: 109 | 4 我的建议是下次用2%或者5%的input。
做TF的CHIP本身就是很难。你的TFbinding确实很低，所以你需要做一个IgG control,
或者NO AB CONTROL。
还有你现在这种比较方法不是很科学，因为你在比较2个SAMPLE出来的DNA。 每个
SAMPLE 的handling都会造成很大的误差，所以你需要normalize到一个control DNA
region.
1/9*1/(2^6)
which is extremely low.
这个数值你现在show的其实没有任何意义，你这个数值如果跟SAMPLE B比较，其实很高
，但是不能证明这个TF就bind这个地方。
你需要screen其他的region在SAMPLE A里面, 如果你其他的region出来的都是1/9*1/(2
^6) 这个值，那么说明你这个值没有任何意义。
CHIP绝对值的YIELD比较没有什么意义，不同人做CHIP的方法不同，你可以用histone
H3 antibody做个CHIP，看看yield。
最完美的CHIP是这种
有IGG control,有KO CELL LINE control, 有different region control。
IGG control在different region表达都很低。
KO CELL LINE 出来的CHIP和IGG control的YIELD很接近，而且在每个region都接近。
positive control cell line出来的CHIP， 只在特定的一个region出现很高的yield，
但是在其他的region,yield和KO 还有IGG control相当。
最后用chip/input%的方式来表达，不要任何的normalization. 这是最完美的CHIP
FIGURE。 |
g*********3
发帖数: 177 | 5 谢谢toll的回答。不好意思，我有一个typo，已经改正过来了。Ct difference in
sample is 6.
嗯，Input确实可以用1%来做，不过在QPCR之前，我测了浓度，也做了QPCR dilution
test，所以这个应该不是问题。
你提的建议很好，我其实也做了negative primer qpcr,做出来的Ct是NA，说明CHIP结
果的特异性还是不错的。
我说的control就是你提到的KO cell line.
"最后用chip/input%的方式来表达，不要任何的normalization"
这其实也是我最感兴趣的信息，我查了几篇paper，发现别人用HA tag做的CHIP，yield
也很低，大概只能pull down 2%左右的DNA （方法也是通过比较Input和Sample这个某
个特定region的QPCR ct）。
我知道IP nuclear protein效率大概是10-20%或者更低点，但没想到DNA的效率这么低
。还是我实验出了问题，
请问有什么步骤是需要优化的吗？
谢谢toll和各位。
【在 t**l 的大作中提到】
: 我的建议是下次用2%或者5%的input。
: 做TF的CHIP本身就是很难。你的TFbinding确实很低，所以你需要做一个IgG control,
: 或者NO AB CONTROL。
: 还有你现在这种比较方法不是很科学，因为你在比较2个SAMPLE出来的DNA。 每个
: SAMPLE 的handling都会造成很大的误差，所以你需要normalize到一个control DNA
: region.
: 1/9*1/(2^6)
: which is extremely low.
: 这个数值你现在show的其实没有任何意义，你这个数值如果跟SAMPLE B比较，其实很高
: ，但是不能证明这个TF就bind这个地方。
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t**l
发帖数: 109 | 6 如果你真觉得yield太低，试试用同样的方法做histone H3 的CHIP。如果连HISTONE
CHIP都低，那么就是你自己CHIP的问题。yield低有可能也是抗体和cell 本身的问题，
比如做实验的时间，需要一些cytokine pre-treatment之类,也学你的TF只有在某个特
定的signaling pathway激活的2个小时候才bind DNA，或者就是你的抗体不好。 |
