y*****0
发帖数: 15 | 1 请教一个问题，准备给一个cell line 里的一个基因加上GFP，已经有construct，是个
BAC，理论上切一下，电转一下，就可以筛选 neomycin resistant 的 clone 了。但发
现这个cell line 已经有 Neo resistant 的基因，所以不能筛选Neo resistant clone
了。能不能直接筛选 GFP 阳性的细胞，然后培养呢？会不会效率很低呢？谢谢。 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 我不熟悉BAC vector, 不知道你们的稳定转化效率有多少。
但是我们用病毒的时候，因为稳定转化率很高，所以可以直接筛荧光而不用药物。
如果你要拿到稳定转化的细胞株，那么必须有比较高的稳定转化率，如果是类似于普通
质粒那种几万分之一那种概率的话没戏。
clone
【在 y*****0 的大作中提到】
: 请教一个问题，准备给一个cell line 里的一个基因加上GFP，已经有construct，是个
: BAC，理论上切一下，电转一下，就可以筛选 neomycin resistant 的 clone 了。但发
: 现这个cell line 已经有 Neo resistant 的基因，所以不能筛选Neo resistant clone
: 了。能不能直接筛选 GFP 阳性的细胞，然后培养呢？会不会效率很低呢？谢谢。
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s******r
发帖数: 1245 | 3 直接筛GFP阳性我搞过，得看是啥位点，基因够不够强，不在乎失败的可以试试
另外双neo可能抗g418浓度会高一点，可以试试多加点加到原来的line开始抗不住
clone
【在 y*****0 的大作中提到】
: 请教一个问题，准备给一个cell line 里的一个基因加上GFP，已经有construct，是个
: BAC，理论上切一下，电转一下，就可以筛选 neomycin resistant 的 clone 了。但发
: 现这个cell line 已经有 Neo resistant 的基因，所以不能筛选Neo resistant clone
: 了。能不能直接筛选 GFP 阳性的细胞，然后培养呢？会不会效率很低呢？谢谢。
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y*****0
发帖数: 15 | 4 多谢二位！
【在 s******r 的大作中提到】
: 直接筛GFP阳性我搞过，得看是啥位点，基因够不够强，不在乎失败的可以试试
: 另外双neo可能抗g418浓度会高一点，可以试试多加点加到原来的line开始抗不住
:
: clone
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s********r
发帖数: 312 | 5 看你叙述的像是用BAC同源重组knock-in GFP， 这样的话不筛选基本不太可能吧。。 |
m*****z
发帖数: 1451 | 6 基本没戏。就算你的基因表达够强，BAC knockin效率可能远远低于FACS本身带来的
false positive GFP signal的比例。
clone
【在 y*****0 的大作中提到】
: 请教一个问题，准备给一个cell line 里的一个基因加上GFP，已经有construct，是个
: BAC，理论上切一下，电转一下，就可以筛选 neomycin resistant 的 clone 了。但发
: 现这个cell line 已经有 Neo resistant 的基因，所以不能筛选Neo resistant clone
: 了。能不能直接筛选 GFP 阳性的细胞，然后培养呢？会不会效率很低呢？谢谢。
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