c***y 发帖数: 615 | 1 transcriptome analysis需要normalized cDNA吗?
通常什么情况下需要normalized cDNA?
多谢了! |
B8 发帖数: 92 | |
g*r 发帖数: 67 | 3 一般来说,如果目标是differential expression,不应用normalization。
normalization的一个好处是会降低整个转录组中高表达基因的含量。
早期测序实验很昂贵,如果大部分数据重复用在高表达基因身上,从gene discovery角
度来看是很浪费的。
个人意见。 |
c***y 发帖数: 615 | 4 那是不是一个未知样本作RNAseq,同时作两个library比较好,normalized 可以看看到
底那些基因表达, non-normalized, 看看相当基因表达abundance??
【在 g*r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 一般来说,如果目标是differential expression,不应用normalization。 : normalization的一个好处是会降低整个转录组中高表达基因的含量。 : 早期测序实验很昂贵,如果大部分数据重复用在高表达基因身上,从gene discovery角 : 度来看是很浪费的。 : 个人意见。
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g*r 发帖数: 67 | 5 未知是指物种没有已知的基因组参照? 还是指没有类似的实验结果?
如果经费不是问题,当然可以制两种library。
对已知物种一般没必要normalization。基因表达量太低,生物学意义也不明了。
对未知物种,当ribosomal depletion 或polyA seletion 成功,并且sequencing
depth足够高,绝大部分有表达的基因都能测到。
normalization可以降低高表达基因的读数,但我也不确定会不会提高低表达基因的读
数。你可以先拿public data做research看变化有多大。无责任推测不会有太大帮助,
因为被测出来的基因都起码有一定的表达量。
【在 c***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那是不是一个未知样本作RNAseq,同时作两个library比较好,normalized 可以看看到 : 底那些基因表达, non-normalized, 看看相当基因表达abundance??
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c***y 发帖数: 615 | 6 我目前的数据,illumina 都是non-normalized, pacbio都是normalized
难道pacbio已经被认为不够deep???
【在 g*r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 未知是指物种没有已知的基因组参照? 还是指没有类似的实验结果? : 如果经费不是问题,当然可以制两种library。 : 对已知物种一般没必要normalization。基因表达量太低,生物学意义也不明了。 : 对未知物种,当ribosomal depletion 或polyA seletion 成功,并且sequencing : depth足够高,绝大部分有表达的基因都能测到。 : normalization可以降低高表达基因的读数,但我也不确定会不会提高低表达基因的读 : 数。你可以先拿public data做research看变化有多大。无责任推测不会有太大帮助, : 因为被测出来的基因都起码有一定的表达量。
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g*r 发帖数: 67 | 7 pacbio的数据产量低。除非基因组很小,要deep就上illumina。
比较这两种平台,illumina的优势是量大质优又便宜,pacbio的优势是序列很长。各自
的优点都是对方的弱点,因此常有人在两种平台上都测。pacbio用于测基因组比较常见
,因为long read对解决repeat/duplicated区域很有帮助。
你已经在illumina测了non-normalized,pacbio要扬长避短测normalized,这是很合理
的。
【在 c***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我目前的数据,illumina 都是non-normalized, pacbio都是normalized : 难道pacbio已经被认为不够deep???
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G*****h 发帖数: 320 | 8 计算 FPKM 本身应该就是一种 normalization 吧?
此外,可以在样本中添加 “External RNA Controls Consortium” exogenous spike-
in mRNAs,并用它们来 normalization 或者对照。这样可以用传统的和新的方法看看
能否找到不同的 DE genes,然后用 qRT-PCR 检测。
文献:Loven J, Orlando DA, Sigova AA, Lin CY, Rahl PB, Burge CB, Levens DL,
Lee TI, Young RA (2012). Revisiting global gene expression analysis. Cell.
151(3):476-482. PMID: 23101621; PMCID: PMC3505597 |
g*r 发帖数: 67 | 9 楼主说的是制library过程中的normalization。跟数据分析中的fpkm normalization目
的是不一样的。
ERCC spike-in没用过,效果如何不便评价。只是目前看来没有普及,光打雷不下雨。
楼主勇于尝试是好事,到时记得分享经验阿。
spike-
,
【在 G*****h 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 计算 FPKM 本身应该就是一种 normalization 吧? : 此外,可以在样本中添加 “External RNA Controls Consortium” exogenous spike- : in mRNAs,并用它们来 normalization 或者对照。这样可以用传统的和新的方法看看 : 能否找到不同的 DE genes,然后用 qRT-PCR 检测。 : 文献:Loven J, Orlando DA, Sigova AA, Lin CY, Rahl PB, Burge CB, Levens DL, : Lee TI, Young RA (2012). Revisiting global gene expression analysis. Cell. : 151(3):476-482. PMID: 23101621; PMCID: PMC3505597
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c***y 发帖数: 615 | 10 多谢回复!
【在 g*r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : pacbio的数据产量低。除非基因组很小,要deep就上illumina。 : 比较这两种平台,illumina的优势是量大质优又便宜,pacbio的优势是序列很长。各自 : 的优点都是对方的弱点,因此常有人在两种平台上都测。pacbio用于测基因组比较常见 : ,因为long read对解决repeat/duplicated区域很有帮助。 : 你已经在illumina测了non-normalized,pacbio要扬长避短测normalized,这是很合理 : 的。
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c***y 发帖数: 615 | 11 是的,我说的事tech层面的normalization, 不是数据分析的normalization
【在 g*r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 楼主说的是制library过程中的normalization。跟数据分析中的fpkm normalization目 : 的是不一样的。 : ERCC spike-in没用过,效果如何不便评价。只是目前看来没有普及,光打雷不下雨。 : 楼主勇于尝试是好事,到时记得分享经验阿。 : : spike- : ,
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