c***y
发帖数: 615 | 1 transcriptome analysis需要normalized cDNA吗？
通常什么情况下需要normalized cDNA?
多谢了！ |
B8
发帖数: 92 | |
g*r
发帖数: 67 | 3 一般来说，如果目标是differential expression，不应用normalization。
normalization的一个好处是会降低整个转录组中高表达基因的含量。
早期测序实验很昂贵，如果大部分数据重复用在高表达基因身上，从gene discovery角
度来看是很浪费的。
个人意见。 |
c***y
发帖数: 615 | 4 那是不是一个未知样本作RNAseq,同时作两个library比较好，normalized 可以看看到
底那些基因表达， non-normalized, 看看相当基因表达abundance??
【在 g*r 的大作中提到】
: 一般来说，如果目标是differential expression，不应用normalization。
: normalization的一个好处是会降低整个转录组中高表达基因的含量。
: 早期测序实验很昂贵，如果大部分数据重复用在高表达基因身上，从gene discovery角
: 度来看是很浪费的。
: 个人意见。
|
g*r
发帖数: 67 | 5 未知是指物种没有已知的基因组参照? 还是指没有类似的实验结果?
如果经费不是问题，当然可以制两种library。
对已知物种一般没必要normalization。基因表达量太低，生物学意义也不明了。
对未知物种，当ribosomal depletion 或polyA seletion 成功，并且sequencing
depth足够高，绝大部分有表达的基因都能测到。
normalization可以降低高表达基因的读数，但我也不确定会不会提高低表达基因的读
数。你可以先拿public data做research看变化有多大。无责任推测不会有太大帮助，
因为被测出来的基因都起码有一定的表达量。
【在 c***y 的大作中提到】
: 那是不是一个未知样本作RNAseq,同时作两个library比较好，normalized 可以看看到
: 底那些基因表达， non-normalized, 看看相当基因表达abundance??
|
c***y
发帖数: 615 | 6 我目前的数据，illumina 都是non-normalized, pacbio都是normalized
难道pacbio已经被认为不够deep???
【在 g*r 的大作中提到】
: 未知是指物种没有已知的基因组参照? 还是指没有类似的实验结果?
: 如果经费不是问题，当然可以制两种library。
: 对已知物种一般没必要normalization。基因表达量太低，生物学意义也不明了。
: 对未知物种，当ribosomal depletion 或polyA seletion 成功，并且sequencing
: depth足够高，绝大部分有表达的基因都能测到。
: normalization可以降低高表达基因的读数，但我也不确定会不会提高低表达基因的读
: 数。你可以先拿public data做research看变化有多大。无责任推测不会有太大帮助，
: 因为被测出来的基因都起码有一定的表达量。
|
g*r
发帖数: 67 | 7 pacbio的数据产量低。除非基因组很小，要deep就上illumina。
比较这两种平台，illumina的优势是量大质优又便宜，pacbio的优势是序列很长。各自
的优点都是对方的弱点，因此常有人在两种平台上都测。pacbio用于测基因组比较常见
，因为long read对解决repeat/duplicated区域很有帮助。
你已经在illumina测了non-normalized，pacbio要扬长避短测normalized，这是很合理
的。
【在 c***y 的大作中提到】
: 我目前的数据，illumina 都是non-normalized, pacbio都是normalized
: 难道pacbio已经被认为不够deep???
|
G*****h
发帖数: 320 | 8 计算 FPKM 本身应该就是一种 normalization 吧？
此外，可以在样本中添加 “External RNA Controls Consortium” exogenous spike-
in mRNAs，并用它们来 normalization 或者对照。这样可以用传统的和新的方法看看
能否找到不同的 DE genes，然后用 qRT-PCR 检测。
文献：Loven J, Orlando DA, Sigova AA, Lin CY, Rahl PB, Burge CB, Levens DL,
Lee TI, Young RA (2012). Revisiting global gene expression analysis. Cell.
151(3):476-482. PMID: 23101621; PMCID: PMC3505597 |
g*r
发帖数: 67 | 9 楼主说的是制library过程中的normalization。跟数据分析中的fpkm normalization目
的是不一样的。
ERCC spike-in没用过，效果如何不便评价。只是目前看来没有普及，光打雷不下雨。
楼主勇于尝试是好事，到时记得分享经验阿。
spike-
,
【在 G*****h 的大作中提到】
: 计算 FPKM 本身应该就是一种 normalization 吧？
: 此外，可以在样本中添加 “External RNA Controls Consortium” exogenous spike-
: in mRNAs，并用它们来 normalization 或者对照。这样可以用传统的和新的方法看看
: 能否找到不同的 DE genes，然后用 qRT-PCR 检测。
: 文献：Loven J, Orlando DA, Sigova AA, Lin CY, Rahl PB, Burge CB, Levens DL,
: Lee TI, Young RA (2012). Revisiting global gene expression analysis. Cell.
: 151(3):476-482. PMID: 23101621; PMCID: PMC3505597
|
c***y
发帖数: 615 | 10 多谢回复！
【在 g*r 的大作中提到】
: pacbio的数据产量低。除非基因组很小，要deep就上illumina。
: 比较这两种平台，illumina的优势是量大质优又便宜，pacbio的优势是序列很长。各自
: 的优点都是对方的弱点，因此常有人在两种平台上都测。pacbio用于测基因组比较常见
: ，因为long read对解决repeat/duplicated区域很有帮助。
: 你已经在illumina测了non-normalized，pacbio要扬长避短测normalized，这是很合理
: 的。
|
c***y
发帖数: 615 | 11 是的，我说的事tech层面的normalization, 不是数据分析的normalization
【在 g*r 的大作中提到】
: 楼主说的是制library过程中的normalization。跟数据分析中的fpkm normalization目
: 的是不一样的。
: ERCC spike-in没用过，效果如何不便评价。只是目前看来没有普及，光打雷不下雨。
: 楼主勇于尝试是好事，到时记得分享经验阿。
:
: spike-
: ,
|
