m*********D
发帖数: 1727 | 1 看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里面酶切出来，gel纯化后再和cas9
plasmid一起co-transfect吗？要作ssDNA太难了一点，还没考虑。：（。
很多年前作过ssDNA的transfection（pUC18？phage-ssDNA纯化的)，记得当时发现
ssDNA在真核细胞内不如dsDNA的plasmid稳定呢。不知道dsDNA fragment在细胞内是不
是也象环状的plasmid那么稳定。
多谢！ |
r*******y
发帖数: 48 | 2 you just need synthesized ssODN as a template for transfection; it is not
necessary to subclone it into plasmd and then release it. |
m*********D
发帖数: 1727 | 3 我需要突变的区域大了一点，有60-70bp的间隔，所以，不能合成ssDNA.
谢谢！
【在 r*******y 的大作中提到】
: you just need synthesized ssODN as a template for transfection; it is not
: necessary to subclone it into plasmd and then release it.
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j******i
发帖数: 939 | 4 不需要切出来。两个plasmid co-transfection即可。需要考虑的就是donor本身不被
cas9切割。 |
Z****7
发帖数: 402 | 5 n
cas9
【在 m*********D 的大作中提到】
: 看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
: template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
: 想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
: 多了，也许这是一个解释。
: 我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
: mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
: mutation后，就可以用作HDR template了。
: 想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里面酶切出来，gel纯化后再和cas9
: plasmid一起co-transfect吗？要作ssDNA太难了一点，还没考虑。：（。
: 很多年前作过ssDNA的transfection（pUC18？phage-ssDNA纯化的)，记得当时发现
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H****S
发帖数: 40 | 6 Just synthesize ss donor with G-block @ IDTdna
2-3kb is easy for G-block synthesis |
m*********D
发帖数: 1727 | 7 谢谢提醒！在考虑把PAM里面的两个GG干掉一个，又不改变amino acid。
【在 j******i 的大作中提到】
: 不需要切出来。两个plasmid co-transfection即可。需要考虑的就是donor本身不被
: cas9切割。
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m*********D
发帖数: 1727 | 8 n=No? 谢谢！
【在 Z****7 的大作中提到】
: n
:
: cas9
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m*********D
发帖数: 1727 | 9 看了IDT的website,他们的G-block合成，两个arm之间之容许20nt的随机sequence。而
我的有60-70nt。只自己克隆了。：（。
谢谢！
【在 H****S 的大作中提到】
: Just synthesize ss donor with G-block @ IDTdna
: 2-3kb is easy for G-block synthesis
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c******d
发帖数: 647 | 10 非行家，不过最近也在做HDR template，
网上关于sgRNA的资源就不说了，但是关于HDR的简直太少
真的是有做的人可能就直接合成ssODN了，可是我想插入比如FP，两边的arm也想1-1.
5kb 长，所以现在也想自己设计plasmid,现在还没做到那步
Zhang的paper说应该linearize donor vector;但我看到别的source说如果用
linearized donor,会增加随机integration的可能，用全plasmid就可以了
cas9
【在 m*********D 的大作中提到】
: 看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
: template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
: 想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
: 多了，也许这是一个解释。
: 我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
: mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
: mutation后，就可以用作HDR template了。
: 想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里面酶切出来，gel纯化后再和cas9
: plasmid一起co-transfect吗？要作ssDNA太难了一点，还没考虑。：（。
: 很多年前作过ssDNA的transfection（pUC18？phage-ssDNA纯化的)，记得当时发现
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s*********y
发帖数: 292 | 11 几个月前第一次做，3Xflag knockin，挑了20个克隆有俩
从那之后knockin就再也没成功过
knockout感觉确实挺好做的
【在 c******d 的大作中提到】
: 非行家，不过最近也在做HDR template，
: 网上关于sgRNA的资源就不说了，但是关于HDR的简直太少
: 真的是有做的人可能就直接合成ssODN了，可是我想插入比如FP，两边的arm也想1-1.
: 5kb 长，所以现在也想自己设计plasmid,现在还没做到那步
: Zhang的paper说应该linearize donor vector;但我看到别的source说如果用
: linearized donor,会增加随机integration的可能，用全plasmid就可以了
:
: cas9
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l***y
发帖数: 638 | 12 HDR插长片段用全plasmid就行，ssODN在人的细胞系里效率很低
【在 c******d 的大作中提到】
: 非行家，不过最近也在做HDR template，
: 网上关于sgRNA的资源就不说了，但是关于HDR的简直太少
: 真的是有做的人可能就直接合成ssODN了，可是我想插入比如FP，两边的arm也想1-1.
: 5kb 长，所以现在也想自己设计plasmid,现在还没做到那步
: Zhang的paper说应该linearize donor vector;但我看到别的source说如果用
: linearized donor,会增加随机integration的可能，用全plasmid就可以了
:
: cas9
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m*********D
发帖数: 1727 | 13 谢谢！我也是钢开始设计，一大堆primer下个礼拜要送出去，所以来这里先请教。
我知道linearized plasmid随机插入genome的拷贝数多，一个点往往是几十拷贝，而环
状plasmid每个插入点是但拷贝的。倒不知道你说的这个插入机会也增加呢。不
linearization还少一步，何乐而不为呢。：）。
Have a good day!
【在 c******d 的大作中提到】
: 非行家，不过最近也在做HDR template，
: 网上关于sgRNA的资源就不说了，但是关于HDR的简直太少
: 真的是有做的人可能就直接合成ssODN了，可是我想插入比如FP，两边的arm也想1-1.
: 5kb 长，所以现在也想自己设计plasmid,现在还没做到那步
: Zhang的paper说应该linearize donor vector;但我看到别的source说如果用
: linearized donor,会增加随机integration的可能，用全plasmid就可以了
:
: cas9
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m*****z
发帖数: 1451 | 14 没有selection marker吗？good luck with your clonal screening
【在 m*********D 的大作中提到】
: 谢谢！我也是钢开始设计，一大堆primer下个礼拜要送出去，所以来这里先请教。
: 我知道linearized plasmid随机插入genome的拷贝数多，一个点往往是几十拷贝，而环
: 状plasmid每个插入点是但拷贝的。倒不知道你说的这个插入机会也增加呢。不
: linearization还少一步，何乐而不为呢。：）。
: Have a good day!
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m*********D
发帖数: 1727 | 15 嘿嘿，准备赌一把。
我这个要mutate的基因是我要用的host cell生长必需的，是一个激素受体。mutant呢
，据说不需要激素也有活性了。所以，就想用没有激素的medium来筛选。希望wt的长不
出来或很慢。
另外，和老板谈了一下，理想状态是两个拷贝都mutate.但一个也能接受。我在想，要
是一个拷贝被knockout,一个被mutate也行。所以，strategy上，我想用两个guide
sequences.两个相距不远，大约是40 bp away。老板让我线赌一把，实在不行，就分两
步，先作stable cell line, 把mutant在这个细胞里表达，然后再来个CRISPR
knockout。
多谢你的指导和建议！这里真不错，都是同行，能相互学很多东西。
【在 m*****z 的大作中提到】
: 没有selection marker吗？good luck with your clonal screening
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c******d
发帖数: 647 | 16 我还有个问题想问你呢，
这个HDR template一般用什么vector backbone呀，还是理论上什么都可以？
哪里可以买到不？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 谢谢！我也是钢开始设计，一大堆primer下个礼拜要送出去，所以来这里先请教。
: 我知道linearized plasmid随机插入genome的拷贝数多，一个点往往是几十拷贝，而环
: 状plasmid每个插入点是但拷贝的。倒不知道你说的这个插入机会也增加呢。不
: linearization还少一步，何乐而不为呢。：）。
: Have a good day!
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m*********D
发帖数: 1727 | 17 你这一问，也让我糊涂了。：）。
当年作knockout老鼠的construct的时候都是用pUC18-19，最后是linearized后
electroporation。你这一问，我去查了一下我准备用的vector,是一个mammalian
expression vector,后面有个0.6Kb 的polyA signal，好像是从人的基因来的，这不是
增加了和那个位点的homologous recombination机会么。
咱俩一起问：谁有经验和建议？谢谢！
【在 c******d 的大作中提到】
: 我还有个问题想问你呢，
: 这个HDR template一般用什么vector backbone呀，还是理论上什么都可以？
: 哪里可以买到不？
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s********r
发帖数: 312 | 18 随便什么backbone都可以，越简单越小越好，最好就是只有ori跟amp这样的
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这一问，也让我糊涂了。：）。
: 当年作knockout老鼠的construct的时候都是用pUC18-19，最后是linearized后
: electroporation。你这一问，我去查了一下我准备用的vector,是一个mammalian
: expression vector,后面有个0.6Kb 的polyA signal，好像是从人的基因来的，这不是
: 增加了和那个位点的homologous recombination机会么。
: 咱俩一起问：谁有经验和建议？谢谢！
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c******d
发帖数: 647 | 19 如果我就是想插一个GFP,那一般的EGFP-N1 就可以是吧，这个应该算比较小的了
【在 s********r 的大作中提到】
: 随便什么backbone都可以，越简单越小越好，最好就是只有ori跟amp这样的
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m*********D
发帖数: 1727 | 20 谢谢！刚找了一遍pUC18/19，都十多年没用过了，哪里找得到！还好，试验室好像有一
个自己作的cloning vector,估计是在pUC上多加了几个克隆酶位点，大小差不多（less
than 3kb)，应该可以用。
好，genomic region全sequence了，有两个SNP, 在intron region,也就是作HDR的ARMS
上，对整个设计没有影响。primers全送出去了，就等克隆一类。今天把几个要用的酶
买回来就可以过节了。
搞的这么复杂主要是想test我们自己筛选出来的compound。compound在WT上肯定每问题
，这些mutant是现有drug-resistant的病人里找出来的，所以，怀疑是drug-resistant
的机理之一。我要能建好一个细胞系，两个拷贝都突变的话，就把我们的compound往前
推进一大步。一个copy突变，一个不突变，该是病人的真实情况，但两个拷贝之间的表
达不清楚，所以，我要运气好，两个都变成mutant，那就太好了。
【在 s********r 的大作中提到】
: 随便什么backbone都可以，越简单越小越好，最好就是只有ori跟amp这样的
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m*****z
发帖数: 1451 | 21 还是有selection的嘛。不过hdr效率会比indels要低得多，很有可能大部分clones会是
你所谓的knockout
【在 m*********D 的大作中提到】
: 嘿嘿，准备赌一把。
: 我这个要mutate的基因是我要用的host cell生长必需的，是一个激素受体。mutant呢
: ，据说不需要激素也有活性了。所以，就想用没有激素的medium来筛选。希望wt的长不
: 出来或很慢。
: 另外，和老板谈了一下，理想状态是两个拷贝都mutate.但一个也能接受。我在想，要
: 是一个拷贝被knockout,一个被mutate也行。所以，strategy上，我想用两个guide
: sequences.两个相距不远，大约是40 bp away。老板让我线赌一把，实在不行，就分两
: 步，先作stable cell line, 把mutant在这个细胞里表达，然后再来个CRISPR
: knockout。
: 多谢你的指导和建议！这里真不错，都是同行，能相互学很多东西。
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m*****z
发帖数: 1451 | 22 mutant 会有gain of function吗
less
ARMS
resistant
【在 m*********D 的大作中提到】
: 谢谢！刚找了一遍pUC18/19，都十多年没用过了，哪里找得到！还好，试验室好像有一
: 个自己作的cloning vector,估计是在pUC上多加了几个克隆酶位点，大小差不多（less
: than 3kb)，应该可以用。
: 好，genomic region全sequence了，有两个SNP, 在intron region,也就是作HDR的ARMS
: 上，对整个设计没有影响。primers全送出去了，就等克隆一类。今天把几个要用的酶
: 买回来就可以过节了。
: 搞的这么复杂主要是想test我们自己筛选出来的compound。compound在WT上肯定每问题
: ，这些mutant是现有drug-resistant的病人里找出来的，所以，怀疑是drug-resistant
: 的机理之一。我要能建好一个细胞系，两个拷贝都突变的话，就把我们的compound往前
: 推进一大步。一个copy突变，一个不突变，该是病人的真实情况，但两个拷贝之间的表
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m*********D
发帖数: 1727 | 23 按别人的文章，应该是mutant不需要ligand也有活性，还很高。这也是我们设计的：
medium里要没有ligand,WT长不出来或长很慢；mutant正常长。现在还不知道人家data
有多少可靠性。人家也没作细胞生长的试验，只有reporter。我们只能合理推断。
Thanks!
【在 m*****z 的大作中提到】
: mutant 会有gain of function吗
:
: less
: ARMS
: resistant
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