r******g
发帖数: 600 | 1 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
transfection）.
结果：
1. HA-Nter clone 和 HA-Cter clone 都表达了（用HA antibody，westerblot）。但
是！！！！ HA-Nter clone的蛋白（15kd supposely），在 15kd只有一条非常模糊 并
且 非常 浅的band，反而在70kd左右有一条非常深和clean的band。HA-Cter-clone 在
正确的
Molecular weight。
2. 唯一的可以probe 这个mitochondrial protein的 抗体，epitope在N terminus。所
以，我们用了 这个抗体，发现一模一样的结果，HA-Nter clone的蛋白（15kd
supposely），在 15kd只有一条非常模糊 并且 非常 浅的band，反而在70kd左右有一
条非常深和clean的band。
3. 我们用了confocal 来看蛋白的localization， HA-Nter clone和 HA-Cter clone蛋
白 都清晰的 位于线粒体膜。
结论：
1. 蛋白表达了
2. 蛋白 在该表达的位置 表达了
3. HA-Nter-clone蛋白molecular weight 不对，recombinant protein形成aggregates
???或者其他原因？？？ 怎么解决这个问题？
因为这个原因，这个side project算是搁浅了，好久没做了...
请各位给点建议，谢谢啦！ |
i**********a
发帖数: 1402 | |
r******g
发帖数: 600 | 3 有full length，untagged 的对照～ 也有full length, tagged的对照～ molecular
weight没有问题
我没有克隆 untagged的 N-ter truncated protein 或者 C-ter trucated protein,
另外，没有争对 C-ter truncated region的 抗体
唯一的抗体 是对Nter的epitope
【在 i**********a 的大作中提到】
: 你的WB有负对照吗，就是untagged。
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l******a
发帖数: 3339 | 4 参见楼主的结果2
【在 i**********a 的大作中提到】
: 你的WB有负对照吗，就是untagged。
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l******a
发帖数: 3339 | 5 HA-Nter clone 和 HA-Cter clone在同一个vector上？两个promotor，还是怎么做的？
ter
【在 r******g 的大作中提到】
: 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
: 我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
: transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
: region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
: region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
: clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
: 小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
: retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
: 接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
: transfection）.
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r******g
发帖数: 600 | 6 sorry，没有讲明白
2个 独立plasmids,都是retroviral plasmids
promotor是 CMV
最后克隆的两个plasmids
HA-Nter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- N-terimus+Transmembrane domain+a
few more C-ter nucleotides----- IRES------EGFP
HA-Cter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- Transmembrane domain+C-terminus-
---- IRES------EGFP
【在 l******a 的大作中提到】
: HA-Nter clone 和 HA-Cter clone在同一个vector上？两个promotor，还是怎么做的？
:
: ter
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e****s
发帖数: 1125 | 7 Double check 你的克隆。Make sure stop code是正确的，没有产生Frame shift.
我觉得最可能的解释就是Frame shift，所以你的蛋白和Tag都在，但在后段可能有
Frame shift突变，把Stop code给突变了。所以一直表达到70K，遇见另一个Stop code
再停下来。
+a
terminus-
【在 r******g 的大作中提到】
: sorry，没有讲明白
: 2个 独立plasmids,都是retroviral plasmids
: promotor是 CMV
: 最后克隆的两个plasmids
: HA-Nter
: CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- N-terimus+Transmembrane domain+a
: few more C-ter nucleotides----- IRES------EGFP
: HA-Cter
: CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- Transmembrane domain+C-terminus-
: ---- IRES------EGFP
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r******g
发帖数: 600 | 8 这个是 我第一个检查的～ doublecheck了很多遍
没问题～
westernblot上面 很明显的，有一个 正常molecular weight的 很浅的lower band，
然后一个很粗的 upper 70kd的band
因为，有lower band，所以，也不大可能是 frameshift，不然 根本不可能有lower
band，对不对？ （293 不表达endogenous的这个 protein）
code
【在 e****s 的大作中提到】
: Double check 你的克隆。Make sure stop code是正确的，没有产生Frame shift.
: 我觉得最可能的解释就是Frame shift，所以你的蛋白和Tag都在，但在后段可能有
: Frame shift突变，把Stop code给突变了。所以一直表达到70K，遇见另一个Stop code
: 再停下来。
:
: +a
: terminus-
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a*****n
发帖数: 2835 | 9 modification?
【在 r******g 的大作中提到】
: 这个是 我第一个检查的～ doublecheck了很多遍
: 没问题～
: westernblot上面 很明显的，有一个 正常molecular weight的 很浅的lower band，
: 然后一个很粗的 upper 70kd的band
: 因为，有lower band，所以，也不大可能是 frameshift，不然 根本不可能有lower
: band，对不对？ （293 不表达endogenous的这个 protein）
:
: code
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n***y
发帖数: 114 | 10 1. 给插入的蛋白和GFP换个位置。
2. 用PP2A。 |
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W*V
发帖数: 13 | 11 using loading buffer containing 4M urea + 2mM 2-mercaptoethanol. If you get
right, please feedback. |
r******g
发帖数: 600 | 12 I will give a try first thing next week. Thanks
You mean loading for Western blot right?
get
【在 W*V 的大作中提到】
: using loading buffer containing 4M urea + 2mM 2-mercaptoethanol. If you get
: right, please feedback.
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W*V
发帖数: 13 | 13 Right. loading samples on gel runing SDS-PAGE. |
i***l
发帖数: 1656 | 14 agree with above,maybe oligomer due to non specific hydrophobic interactions
, which is not uncommon among transmembrane proteins.
4-6M urea, try to completely denature your sample,
however, if oligomer forms, sample usually runs in a ladder pattern, say,
dimer, tetramer, etc. if you only see two major bands, one monomer, the
other ~4x or 6x apparent molecular weight, it's still a little weird to me. |
M******g
发帖数: 152 | 15 Try not to heat up your protein samples in SDS loading buffer. Many
membrane proteins form aggregates even in SDS-loading buffer when they are
heated. 70 kd may be your protein aggregation. |
M******g
发帖数: 152 | 16 Try not to heat up your protein samples in SDS loading buffer. Many
membrane proteins form aggregates even in SDS-loading buffer when they are
heated. 70 kd may be your protein aggregation. |
p****t
发帖数: 18 | 17 可能抗体不特异，楼主可以把70kDa的条带切下来送质谱。
如果是oligomer，质谱也能看出来。
ter
【在 r******g 的大作中提到】
: 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
: 我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
: transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
: region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
: region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
: clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
: 小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
: retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
: 接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
: transfection）.
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