w*********1
发帖数: 27 | 1 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒，转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
观的，但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题，就自己找模板构建载体了，
自己构建了两个载体，一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
Tubulin C 端，一个在N端， 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了，EYFP在
Tubulin C端的（Tubulin-EYFP）质粒表达效率特别低，虽然转染效率还可以，就是
EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的（EYFP-Tubulin）质粒转染Hela之
后，效率倒是相当之后，荧光强度也超赞，但是和人家给我的质粒问题一样，都是
cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
？谢谢啦。 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 可能是你的linker 设计得不够长。
我构建过类似的construct,用起来没有任何问题。 进入微管结构刚刚的。
【在 w*********1 的大作中提到】
: 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒，转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
: 观的，但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
: sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题，就自己找模板构建载体了，
: 自己构建了两个载体，一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
: Tubulin C 端，一个在N端， 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了，EYFP在
: Tubulin C端的（Tubulin-EYFP）质粒表达效率特别低，虽然转染效率还可以，就是
: EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的（EYFP-Tubulin）质粒转染Hela之
: 后，效率倒是相当之后，荧光强度也超赞，但是和人家给我的质粒问题一样，都是
: cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
: ？谢谢啦。
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t******5
发帖数: 67 | 3 这个Linker好像不是常规设计用到的？
【在 s******y 的大作中提到】
: 可能是你的linker 设计得不够长。
: 我构建过类似的construct,用起来没有任何问题。 进入微管结构刚刚的。
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C*******4
发帖数: 400 | 4 Linker和TUBULIN上的Met都要考虑。最好去除第二个MET。可以跑个电泳看看是不是
FULLLENGTH FUSION PROTEIN。 |
w*********1
发帖数: 27 | 5 学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？
【在 C*******4 的大作中提到】
: Linker和TUBULIN上的Met都要考虑。最好去除第二个MET。可以跑个电泳看看是不是
: FULLLENGTH FUSION PROTEIN。
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b*********e
发帖数: 870 | 6 linker 越 flexible越好。常规的话，GSSGSS repeat就行。
：学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
：求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？ |
C*******4
发帖数: 400 | 7 第二个methionine 可能会让转录起始从那里开始而不能产生长系列的融合基因，所以
你表达的只有EGFP或者TUBULIN。如果只有GFP那肯定是核和质里都表达。
link可以用GSL linker，Google一下就能找到。。
[在 winston0771 (kuba) 的大作中提到：]
：学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
：求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？
：........... |
m***y
发帖数: 627 | 8 这两天我刚刚构建好GFP-tubulin质粒并做了转染，效果还不错，Linker5个氨基酸，
Tubulin的第一个M去掉了 |
w*********1
发帖数: 27 | 9 请问您可以看到在interphase的filament以及在mitosis的spindle么？我构建的GFP-
Tubulin绿色荧光超强，可就是看不到丝状结构。看上去也不是GFP，因为在间期里细胞
核没有绿色，绿色都在细胞质里面，但是就是diffuse在细胞质里，不形成微管结构，
这个让我很惆怅。
【在 m***y 的大作中提到】
: 这两天我刚刚构建好GFP-tubulin质粒并做了转染，效果还不错，Linker5个氨基酸，
: Tubulin的第一个M去掉了
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