w*********1 发帖数: 27 | 1 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒,转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
观的,但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题,就自己找模板构建载体了,
自己构建了两个载体,一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
Tubulin C 端,一个在N端, 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了,EYFP在
Tubulin C端的(Tubulin-EYFP)质粒表达效率特别低,虽然转染效率还可以,就是
EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的(EYFP-Tubulin)质粒转染Hela之
后,效率倒是相当之后,荧光强度也超赞,但是和人家给我的质粒问题一样,都是
cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
?谢谢啦。 |
s******y 发帖数: 28562 | 2 可能是你的linker 设计得不够长。
我构建过类似的construct,用起来没有任何问题。 进入微管结构刚刚的。
【在 w*********1 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒,转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微 : 观的,但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a : sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题,就自己找模板构建载体了, : 自己构建了两个载体,一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在 : Tubulin C 端,一个在N端, 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了,EYFP在 : Tubulin C端的(Tubulin-EYFP)质粒表达效率特别低,虽然转染效率还可以,就是 : EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的(EYFP-Tubulin)质粒转染Hela之 : 后,效率倒是相当之后,荧光强度也超赞,但是和人家给我的质粒问题一样,都是 : cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前 : ?谢谢啦。
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t******5 发帖数: 67 | 3 这个Linker好像不是常规设计用到的?
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 可能是你的linker 设计得不够长。 : 我构建过类似的construct,用起来没有任何问题。 进入微管结构刚刚的。
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C*******4 发帖数: 400 | 4 Linker和TUBULIN上的Met都要考虑。最好去除第二个MET。可以跑个电泳看看是不是
FULLLENGTH FUSION PROTEIN。 |
w*********1 发帖数: 27 | 5 学习了,还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么?linker序列有特别要
求么?Met指C端最后的那个氨基酸么?
【在 C*******4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Linker和TUBULIN上的Met都要考虑。最好去除第二个MET。可以跑个电泳看看是不是 : FULLLENGTH FUSION PROTEIN。
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b*********e 发帖数: 870 | 6 linker 越 flexible越好。常规的话,GSSGSS repeat就行。
:学习了,还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么?linker序列有特别要
:求么?Met指C端最后的那个氨基酸么? |
C*******4 发帖数: 400 | 7 第二个methionine 可能会让转录起始从那里开始而不能产生长系列的融合基因,所以
你表达的只有EGFP或者TUBULIN。如果只有GFP那肯定是核和质里都表达。
link可以用GSL linker,Google一下就能找到。。
[在 winston0771 (kuba) 的大作中提到:]
:学习了,还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么?linker序列有特别要
:求么?Met指C端最后的那个氨基酸么?
:........... |
m***y 发帖数: 627 | 8 这两天我刚刚构建好GFP-tubulin质粒并做了转染,效果还不错,Linker5个氨基酸,
Tubulin的第一个M去掉了 |
w*********1 发帖数: 27 | 9 请问您可以看到在interphase的filament以及在mitosis的spindle么?我构建的GFP-
Tubulin绿色荧光超强,可就是看不到丝状结构。看上去也不是GFP,因为在间期里细胞
核没有绿色,绿色都在细胞质里面,但是就是diffuse在细胞质里,不形成微管结构,
这个让我很惆怅。
【在 m***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这两天我刚刚构建好GFP-tubulin质粒并做了转染,效果还不错,Linker5个氨基酸, : Tubulin的第一个M去掉了
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