i********y
发帖数: 23 | 1 大家好，
最近通过qpcr检测到几个基因的表达在我们的实验条件下有变化。所以我想把这个基因
克隆出来。但这个基因实在是没人研究(是个LINC)，所以没人有它的cDNA.所以我想试
试能否把它从cDNA克隆出来。我提取cDNA的办法是：
1. 用RNAeasy提取细胞的RNA,没有用shredder
2. 用iScript转录cDNA.引物用的就是它家的random primer
结果今天做了PCR,什么band都没有，那个郁闷。。。我克隆也做了几年了，很少失败过
。用的是NEB家的Q5.
想问一下大家，是我自己PCR条件没摸好，还是实验本身设计就行不通？我从来没做过
自己提取cDNA然后再克隆gene的。以前都是从公司买现成的cDNA. |
f******k
发帖数: 856 | 2 我自己就这么克隆过基因，没问题。
我觉得是你的条件没摸好。
先看看你PCR的primer有没有问题，看能不能在genomic DNA上扩增出来。直接加几微升
培养的细胞到pcr里做模板。这样省事，PCR变性的温度足够裂解细胞了。 |
j****n
发帖数: 3370 | 3 有钱的直接的gBLOCK或者全合成
没钱的 如果intron不多 可以做oe-pcr或者gibson assembly
没钱intron又很多 只能继续摸条件了
【在 i********y 的大作中提到】
: 大家好，
: 最近通过qpcr检测到几个基因的表达在我们的实验条件下有变化。所以我想把这个基因
: 克隆出来。但这个基因实在是没人研究(是个LINC)，所以没人有它的cDNA.所以我想试
: 试能否把它从cDNA克隆出来。我提取cDNA的办法是：
: 1. 用RNAeasy提取细胞的RNA,没有用shredder
: 2. 用iScript转录cDNA.引物用的就是它家的random primer
: 结果今天做了PCR,什么band都没有，那个郁闷。。。我克隆也做了几年了，很少失败过
: 。用的是NEB家的Q5.
: 想问一下大家，是我自己PCR条件没摸好，还是实验本身设计就行不通？我从来没做过
: 自己提取cDNA然后再克隆gene的。以前都是从公司买现成的cDNA.
|
z*******o
发帖数: 1794 | 4 对于没有人做过的基因我倒是觉得直接从CDNA里面克隆比较好，直接合成都是基于网上
预测，我还真碰到过自己克隆出来的序列和网上预测不一致的情况。好好纯化一下你的
RNA，多换几对引物，只要不是特别大的基因应该没有问题。
[在 imacoolboy (imacoolboy) 的大作中提到：]
:大家好，
:最近通过qpcr检测到几个基因的表达在我们的实验条件下有变化。所以我想把这个基
因克隆出来。但这个基因实在是没人研究(是个LINC)，所以没人有它的cDNA.所以我想试
:试能否把它从cDNA克隆出来。我提取cDNA的办法是：
:1. 用RNAeasy提取细胞的RNA,没有用shredder
:结果今天做了PCR,什么band都没有，那个郁闷。。。我克隆也做了几年了，很少失败
过。用的是NEB家的Q5.
:想问一下大家，是我自己PCR条件没摸好，还是实验本身设计就行不通？我从来没做过
:自己提取cDNA然后再克隆gene的。以前都是从公司买现成的cDNA. |
i********y
发帖数: 23 | 5 我是楼主。
谢谢楼上几位的建议。我现在有个疑问。是先把RNA用random hexamer转成cDNA，然后
在cDNA的基础上用PCR把基因克隆出来好？还是直接在RNA转cDNA的过程中，用克隆的引
物直接克隆出基因比较好？ |
Z******5
发帖数: 435 | 6 反转录的时候，如果random hexamer做引物，当它碰到另外一个模板上结合的hexamer
时候，就会自动终止。所以如果你是拿来做克隆的模板，最好单独用oligo dT做模板搞
出来的cDNA。如果非要用random hexamer，量要控制好，不要太多。 |
i********y
发帖数: 23 | 7 啊哈！我觉得就是这个！我用的是iscript cDNA first-strand kit, 它提供的是
oligodt 和 hexamer的mix.我明天就去订一个只有oligoDt的kit.
另外我想问一下，我有个gene它有6500bp左右长度。在做反转录的时候，您觉得反转的
时间大概需要多久。Biorad说在42℃上放60-90分钟。您觉得够嘛？
hexamer
【在 Z******5 的大作中提到】
: 反转录的时候，如果random hexamer做引物，当它碰到另外一个模板上结合的hexamer
: 时候，就会自动终止。所以如果你是拿来做克隆的模板，最好单独用oligo dT做模板搞
: 出来的cDNA。如果非要用random hexamer，量要控制好，不要太多。
|
s*******h
发帖数: 82 | 8 我们原来都是自己做。有几个关键，基因的长度和表达丰度，如果在3k以内，表达丰度
高，那很好做。如果太长就不好办了，可以试着分片段克隆，再拼起来，很费精力。如
果表达丰度太低，那就选个高的细胞系。有专门的反转录酶可以得到长的cDNA，也可以
试一下，不能保证。 |
s******y
发帖数: 28562 | 9 我以前就经常这么做啊。作出来没有问题啊！
但是，你不应该用random primer，因为这个会弄不到全长基因的。你应该用oligoDT.
如果是丰度比较低的基因，你还应该用nested primer PCR来做第二次扩增。
【在 i********y 的大作中提到】
: 大家好，
: 最近通过qpcr检测到几个基因的表达在我们的实验条件下有变化。所以我想把这个基因
: 克隆出来。但这个基因实在是没人研究(是个LINC)，所以没人有它的cDNA.所以我想试
: 试能否把它从cDNA克隆出来。我提取cDNA的办法是：
: 1. 用RNAeasy提取细胞的RNA,没有用shredder
: 2. 用iScript转录cDNA.引物用的就是它家的random primer
: 结果今天做了PCR,什么band都没有，那个郁闷。。。我克隆也做了几年了，很少失败过
: 。用的是NEB家的Q5.
: 想问一下大家，是我自己PCR条件没摸好，还是实验本身设计就行不通？我从来没做过
: 自己提取cDNA然后再克隆gene的。以前都是从公司买现成的cDNA.
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k*****2
发帖数: 135 | 10 为什么不用gene-specific primer？小心二级结构复杂的时候或者有modification的时
候反转录酶不一定好用。你要不要试试ThermoScript™ RT-PCR System。可以打
电话让他们便宜点，我上次打电话给sales representative直接五折了。 |
A*******e
发帖数: 284 | 11 用Oligo dT反转录啊，random primer不适合做全长克隆 |
Z******5
发帖数: 435 | 12 我记得很久以前看过一个protocol，貌似说反转录60分钟，4kb的没有问题。 我自己做
都是搞120分钟，这个应该没啥坏处。
以前搞过一个6kb多的epigenetic factor，真心不好搞，最后分了4段做overlap PCR才
搞出来了。如果你的目的基因丰度又低，片段又长，真的会很难搞。 最好买个cDNA回
来搞吧。 如果实在不想花那么多钱，做overlap也可以，但是不要搞酶切位点的链接，
用同源重组的链接，这样设计引物自由度会大很多。
【在 i********y 的大作中提到】
: 啊哈！我觉得就是这个！我用的是iscript cDNA first-strand kit, 它提供的是
: oligodt 和 hexamer的mix.我明天就去订一个只有oligoDt的kit.
: 另外我想问一下，我有个gene它有6500bp左右长度。在做反转录的时候，您觉得反转的
: 时间大概需要多久。Biorad说在42℃上放60-90分钟。您觉得够嘛？
:
: hexamer
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h***e
发帖数: 7320 | 13 找个酶切位点，分别克隆试试看，可能还是在你的cDNA里面表达量不高
所以克隆不出来
【在 i********y 的大作中提到】
: 大家好，
: 最近通过qpcr检测到几个基因的表达在我们的实验条件下有变化。所以我想把这个基因
: 克隆出来。但这个基因实在是没人研究(是个LINC)，所以没人有它的cDNA.所以我想试
: 试能否把它从cDNA克隆出来。我提取cDNA的办法是：
: 1. 用RNAeasy提取细胞的RNA,没有用shredder
: 2. 用iScript转录cDNA.引物用的就是它家的random primer
: 结果今天做了PCR,什么band都没有，那个郁闷。。。我克隆也做了几年了，很少失败过
: 。用的是NEB家的Q5.
: 想问一下大家，是我自己PCR条件没摸好，还是实验本身设计就行不通？我从来没做过
: 自己提取cDNA然后再克隆gene的。以前都是从公司买现成的cDNA.
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