f*****n 发帖数: 499 | 1 小弟最近用SH-SY5Y做CRISPR。CRISPR本身是没问题的,但在single cell expansion的
步骤出了问题。
稀释法得到的单细胞在96孔板里生长大概一个星期,就长成一团细胞。但接着细胞就“
扩张”不下去了,只会在那一小团里越长越密,而不像其他细胞可以容易的长满整个96
孔板。
这时候我就用常规的Trypsin来消解,把这一团细胞打散。可问题是,这样处理后细胞
很快就死掉了。
我想请教:
1. SH-SY5Y从单细胞是否可以长满整个96-well的孔?这个细胞可以从single cell长成
一团,为何就无法继续扩张下去了呢
2. 我的问题主要出在哪里呢?我个人分析觉得最大可能是Trypsin过于harsh。而且我
在操作过程中可能Trypsin incubation的时间过长。那么有没有什么相对温和的
Trypsin可以替代呢?我网上查到比如Accutase,不知道大家还有什么别的推荐?
3. 除了SH-SY5Y, 还有什么其他human neuronal cell line推荐呢?感觉神经细胞总是
挺脆弱的。
非常感谢! |
f*****n 发帖数: 499 | 2 ddd
96
【在 f*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 小弟最近用SH-SY5Y做CRISPR。CRISPR本身是没问题的,但在single cell expansion的 : 步骤出了问题。 : 稀释法得到的单细胞在96孔板里生长大概一个星期,就长成一团细胞。但接着细胞就“ : 扩张”不下去了,只会在那一小团里越长越密,而不像其他细胞可以容易的长满整个96 : 孔板。 : 这时候我就用常规的Trypsin来消解,把这一团细胞打散。可问题是,这样处理后细胞 : 很快就死掉了。 : 我想请教: : 1. SH-SY5Y从单细胞是否可以长满整个96-well的孔?这个细胞可以从single cell长成 : 一团,为何就无法继续扩张下去了呢
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n**********g 发帖数: 196 | 3 建议在细胞长成一团时用yellow tip吹几次,会吹死一些细胞,但是会把一坨细胞吹成
很多小块甚至单细胞,很快就长满。 |
p****t 发帖数: 18 | |
f*****n 发帖数: 499 | 5 谢谢
比较好奇,
1.你说的“吹”就是直接在96孔板里用pipette“吹打”吗?
2.等于说直接“吹”就等于代替了trypsin的功能?细胞可以直接detached from
culture dish?
3. 不知道你的这个建议是针对sh-sy5y,还是所有细胞的crispr?
many thanks!
【在 n**********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 建议在细胞长成一团时用yellow tip吹几次,会吹死一些细胞,但是会把一坨细胞吹成 : 很多小块甚至单细胞,很快就长满。
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r*h 发帖数: 24 | |
f*****n 发帖数: 499 | 7 electroporation
That works perfect
Lipo-3000 won't work at all
【在 r*h 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 楼主是用的什么转染方法?化学方法还是病毒?
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v********a 发帖数: 646 | |