m*********D
发帖数: 1727 | 1 （CRISPR的背景资料请参阅Feng Zhang的“Genome engineering using the CRISPR-
Cas9 system”，Nature Protocols 8, 2281–2308 (2013)）
背景
我们是作一个与激素相关的肿瘤的。这个肿瘤的治疗方法已经相当完善，就是让身体里
不能生产激素或用一个小分子化合物抢占激素受体上激素的结合部位。但多年治疗后，
会有相当比例的病人产生抗药性。这个抗药性机理相当复杂。我们实验室一直致力于筛
选和现有药物不同的机理的小分子化合物，包括受体和DNA的结合或其他与受体相关的
pathway的inhibitors。前几年成功地筛选出了几个不同机理的化合物，个别在细胞水
平达到了nM的级别，动物测试也在10 mg/kg的水平。
最近在这个领域对抗药性肿瘤的研究发现，部分病人的抗药性是因为受体激素结合部位
发生了突变。一个或几个氨基酸的突变就能导致肿瘤细胞的生长不能被现有药物抑制。
所以，我们很想知道我们筛选出来的化合物对这些突变受体是不是也起作用。理论上来
说，我们的化合物不和激素竞争，突变不会影响我们化合物的效果。但只有试验才能让
人信服。因为病人的抗药性肿瘤细胞里往往只有受体基因的一个拷贝突变，要测试我们
的化合物，我们必需要用只表达突变受体的细胞。用不表达受体的肿瘤细胞作为host,
表达突变受体的思维方式并不合适。在这样的系统里，肿瘤细胞的生长是不依赖激素的
。这就是我提出用CRISPR/HDR在表达wild type受体的肿瘤细胞里直接突变受体基因的
原因。
设计的思路
A。为提高成功率，决定用两个guide sequences。这有两个好处：1。肿瘤细胞的生长
需要该受体。我们把受体中激素结合的部位删除一段，细胞是不会生长的。这有利于含
突变受体的细胞outgrow；2。不用多花时间来测试guide sequence的效率。理论上，一
个guide就能达到我的目的。用两个，其中一个发挥作用的可能性很大，我就没有测这
两个guide的效率了。
B。我有作knockout老鼠construct的功底，知道同源重组的模板上，两边的同源arm越
长，重组的概率越高，所以，我决定不用popular的合成小片断来作模板，而是作了一
个两边arm各有1.2kb的模板。两个arm中间的部分是突变区，大约60bp。 我设计了两个
不同的酶切位点和arms连接。这样的好处是今后我想对这60bp中间的任何氨基酸突变，
这个construct可以拿来作backbone,只需置换一下这个60bp的区间。
C.引进的两个酶位点不改变氨基酸序列，只方便克隆和后面的genotyping。由于我的两
个guide的DSB位点也在这个60bp区间，我合成这个60bp的fragment时，顺便也把PAM改
了（不改变氨基酸的序列）。这样，一但出现HDR,cas9就不会再切。
D.我真正让老板接受我的设计方案的原因是筛选。我仔细看了文献，发现这些突变的受
体都能在没有激素的情况下，让对应的reporter基因表达，有或没有激素的区别不大。
我就提出了一个筛选的设想：没有激素，含这些突变子的肿瘤细胞应该会生长，而含
wild type受体的host cell没有激素是不生长的。所以，我可以用没有激素的培养液来
筛选。
试验流程
模板直接克隆进pUC18。很容易，两个PCR/酶切好的arms；中间60bp是直接合成的，
annealing一下就好了；pUC18 vector酶切纯化。四个片断一锅“煮”，一次成功。
transfection之前linearize plasmid，纯化后备用。（考虑到linearized plasmid在
细胞里可能没有supercoiled plasmid稳定，我后面用了一半linearized,一半
supercoiled。似乎效率差别不大。）
guide sequences直接克隆进PX459。这个一定要从两端sequencing confirm。
transfection用了LP2000和LP3000。都没问题。
1.5M 细胞铺到100 mm dish 》第二天transfection（10 ug HDR template，5 ug each
guide plasmid)》 第三天,remove the medium，加新的medium和puromycin 》 puro
筛选三天，每天都换medium 》 第五天换成没有puromycin的medium,让细胞recovery一
天 》split cells, 1：4（一个plate到四个plates)，用没有激素的medium筛选两个礼
拜，每三到五天换一次medium。（我的感觉是这个两礼拜的筛选medium，最好加点
conditional medium。一般是考虑30%左右。对在数量稀少的情况下生长慢的细胞系，
conditional medium很可能是必需的。）》显微镜下挑克隆。
conditional medium的准备：细胞在flask里长到30-50% confluence,加入新鲜medium
（注意我必需用没有激素的medium，所以，我会在split时就直接多放点细胞，在30-50
%的水平，用不含激素的medium)。每两天收集medium,用0.2 um filter过滤，4度放两
三个礼拜没有问题。
我第一轮用了96-well plate来稀释puromycin筛选好的细胞，当时每well放了三个细
胞。我puro筛选后的细胞数量大约是15，000，也就是transfection之前的1%。放了两
块plate。同时用了两个100 mm dish,每个放了约1500细胞。两个礼拜后，发现在96-
well上找克隆太费劲，就放弃了。而两个100 mm dish里，肉眼找到了一个长在边沿的
克隆。这个克隆后来在genotyping时证明是两个拷贝都突变了的。正是这个克隆，让我
知道了一轮能拿到多少克隆。以后所有puro筛选出来的细胞全上100 mm dish。
共挑了70个左右的克隆。genotyping后，知道约1/2为单拷贝突变，1/4是双拷贝突变，
另外1/4没有突变。我的genotyping是设计了一对PCR primers,它们正好在我的HDR
template外面，也就是PCR产物包括wild type和mutant。这个PCR产物然后用我在
template里引进的两个酶切。不切的为Wild type，切开的为mutant。最后挑选了十四
个克隆，在mRNA水平上再genotyping，证实了新的酶位点，然后sequencing。
所有70克隆，只有一个克隆出现了两个引进的酶位点，一个切，一个不切的现象。最后
sequencing发现，一个酶位点缺失。但所有其他改变都在。也就是说我们能把
Homologous recombination的地点定位到一个很小的范围（实际上就在那个合成的60bp
区间，不在设计的arm上）。这是唯一一个Homologous recombination的地点离
mutation地点少于50bp的情况。考虑到每个拷贝变成matant需要两次homologous
recombination event（mutation两边，一边一次），这么多克隆就这么一个，我们用
比较长的arms也许是正确的选择。毫无疑问，用合成的小template,同样ug的数量，分
子数可是不一样的。也许用合成的小template，因分子数量多而弥补了短小arm的不足
。这个讨论被reviewer枪毙，认为reasonable但我们没有作对照，没有数据支持。
单拷贝突变的克隆，我们sequencing了7个。酶切不动的拷贝都是有Cas9引进的indels
，但没有HDR发生。七个克隆有五种不同的indels。我们能看出两个guide都起了作用。
有克隆就是直接少了两个DSB中间这一段的；也有一个DSB位点有indels的另一个没有；
还有两个DSB同时有indels的，估计这两个DSB不是同时发生，而是repair好了一个，另
一个再发生的。因为这七个克隆的两个拷贝其实都有突变，我从这里开始，用（单/双
）replacement来区别两组不同的克隆。
所有7个单replacement的克隆中，既然那个没有replace的拷贝都有Cas9造成DSB和
indel的痕迹，因此我们认为很可能我的puromycin筛选三天可能有些过长，只有
transfection过程中吸收了大量DNA的细胞才存活下来。我以往的经验是，
transfection后的第二天表达量最高，第三天就下降很多，第四天第五天就差不多消失
了。这个三天筛选可能比较长了点。而从厂家的网站上的资料表明我们这个细胞的
transfection效率该有30%，我们自己的感觉也应该在5-10%左右，而实际只有1%的细胞
存活，也说明puromycin筛选可能过头。这个puromycin筛选是transfected的细胞，不
需要plamids整合到genome里面，所以，不用长时间筛选。三天是我喜欢用的时间。我
们其实也希望有几个克隆，一个拷贝replaced,一个是wild type。这样就和病人的抗药
性肿瘤细胞接近。可惜没有拿到。也许puromycin筛选两天，我会有更好的机会。
我们拿到的克隆多，统计可能有一定的意义。我计算了一下，大约15，000个
transfected cell，我能拿到十个左右单/双拷贝replaced的克隆。也就是每1000-1500
个transfected 细胞，能拿到一个。我要没有no-hormone medium筛选的话，要拿到一
个克隆还是不容易的，意味着genotype一千个克隆才能拿到一个。我们写文章的时候，
查了一下文献，在细胞水平拿到双replacement的文章我们没有查到（这个技术日新月
异，我们search也不深入，不敢说完全没有。动物模型里有。），单replacement的文
章我们找到了。我们的感觉，要没有办法筛选，作HDR确实不是一件容易的事情。
谢谢这里给我出过主意的网友。我两年前对CRISPR也是一窍不通，来这里问过。特别感
谢上海植物生理所的xiao Han博士。她给了我很多主意和鼓励。她现在应该回上海交大
了，我没有她的联络地址，有认识的网友，请转达我的谢意。 |
b*********1
发帖数: 1054 | 2 大哥越讲我两所从事的东西越接近，我以前就弄激素相关肿瘤，现在跑了。
【在 m*********D 的大作中提到】
: （CRISPR的背景资料请参阅Feng Zhang的“Genome engineering using the CRISPR-
: Cas9 system”，Nature Protocols 8, 2281–2308 (2013)）
: 背景
: 我们是作一个与激素相关的肿瘤的。这个肿瘤的治疗方法已经相当完善，就是让身体里
: 不能生产激素或用一个小分子化合物抢占激素受体上激素的结合部位。但多年治疗后，
: 会有相当比例的病人产生抗药性。这个抗药性机理相当复杂。我们实验室一直致力于筛
: 选和现有药物不同的机理的小分子化合物，包括受体和DNA的结合或其他与受体相关的
: pathway的inhibitors。前几年成功地筛选出了几个不同机理的化合物，个别在细胞水
: 平达到了nM的级别，动物测试也在10 mg/kg的水平。
: 最近在这个领域对抗药性肿瘤的研究发现，部分病人的抗药性是因为受体激素结合部位
|
f*******d
发帖数: 92 | 3 感谢大哥写这么长这么详细的帖子，真是受益不少。建议版主置顶，所有需要做CRISPR
的新手都应该看看！ |
b****s
发帖数: 22 | |
l********e
发帖数: 415 | 5 不错，大赞。
如果为了研究目的，一个allele knockin, 一个allele knockout, 不是也可以么。 |
m*********D
发帖数: 1727 | 6 嘿嘿，这个领域太老了，我们实验室也太老了，要跟上潮流真不容易啊。。。
【在 b*********1 的大作中提到】
: 大哥越讲我两所从事的东西越接近，我以前就弄激素相关肿瘤，现在跑了。
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m*********D
发帖数: 1727 | 7 希望对你有用。我琢磨了一阵，怎么写容易理解。最后觉得张博士的那篇文章还是基础
，不然读我写的太困难。我也没时间写太长。张博士的文章是我的启蒙，我也就大约读
了前几页，后面的我就不用读了。我也推荐给我们实验室的一个学生作启蒙用。她是边
读边和我讨论，现在也在bench上作了。
CRISPR
【在 f*******d 的大作中提到】
: 感谢大哥写这么长这么详细的帖子，真是受益不少。建议版主置顶，所有需要做CRISPR
: 的新手都应该看看！
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m*********D
发帖数: 1727 | 8 谢谢！希望没有误导你。
【在 b****s 的大作中提到】
: 好赞！
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m*********D
发帖数: 1727 | 9 开始也这么想。其实和你突变的地方有一定关系。在基因的起始部位，Knockout比较容
易，在靠近结尾的地方，你会有truncated蛋白表达。这种的活性是无法预料的，如果
是dimer，就更难了。另外，压迫看protein的表达量，靠近结尾的，往往没有合适的
antibody来区分你要的replacement和trancated copy。
【在 l********e 的大作中提到】
: 不错，大赞。
: 如果为了研究目的，一个allele knockin, 一个allele knockout, 不是也可以么。
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l********e
发帖数: 415 | 10 有道理。对于无法筛选的基因，你觉得做两轮targeting怎么样。先拿杂合，然后
target杂合拿纯合。
: 开始也这么想。其实和你突变的地方有一定关系。在基因的起始部位，Knockout
比较容
: 易，在靠近结尾的地方，你会有truncated蛋白表达。这种的活性是无法预料的
，如果
: 是dimer，就更难了。另外，压迫看protein的表达量，靠近结尾的，往往没有合
适的
: antibody来区分你要的replacement和trancated copy。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 开始也这么想。其实和你突变的地方有一定关系。在基因的起始部位，Knockout比较容
: 易，在靠近结尾的地方，你会有truncated蛋白表达。这种的活性是无法预料的，如果
: 是dimer，就更难了。另外，压迫看protein的表达量，靠近结尾的，往往没有合适的
: antibody来区分你要的replacement和trancated copy。
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m*********D
发帖数: 1727 | 11 从我拿到的单双replacement克隆的比例看，不如直接多筛克隆，就差一倍呢。倒是可
以在实验流程上多点手脚，提高机会--如果是细胞生长必需的基因，两个guide有必要
；puro筛选可以比我作的再很一点。另外，可以考虑genotyping的时候，不做单个克隆
，而是一次十个二十个的做，有阳性混在里面后，再把那一组拿出来，克隆，再
genotyping。
要是非必需基因，可以考虑HDR上加一个G418 筛选cassette，放在intron里面，用loxP
放两边，以后用cre切掉。就不知道剩余的一个loxP会不会对splicing有影响。
Knockout
【在 l********e 的大作中提到】
: 有道理。对于无法筛选的基因，你觉得做两轮targeting怎么样。先拿杂合，然后
: target杂合拿纯合。
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: 开始也这么想。其实和你突变的地方有一定关系。在基因的起始部位，Knockout
: 比较容
:
: 易，在靠近结尾的地方，你会有truncated蛋白表达。这种的活性是无法预料的
: ，如果
:
: 是dimer，就更难了。另外，压迫看protein的表达量，靠近结尾的，往往没有合
: 适的
:
: antibody来区分你要的replacement和trancated copy。
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l*******1
发帖数: 16217 | |
