D****g
发帖数: 275 | 1 最近构建了一个arg->gly突变体，本来是猜测这个arginine是一个酶切位点，结果突变
后，蛋白几乎全部消失了，而mRNA水平几乎没有变化。这个arginine以前没有啥报道，
看了下蛋白结构，也没发现有啥重大的做用。现在一点头绪都没有，大家有没有啥建议
？这可能是啥引起的？
🙏 |
r**********7
发帖数: 243 | 2 可能蛋白结构改变，原来的antibody不认识了。 |
y******m
发帖数: 143 | |
D****g
发帖数: 275 | 4 应该不会。用了flag tag antibody和另外两种蛋白特异antibodies，结果是一样的
【在 r**********7 的大作中提到】
: 可能蛋白结构改变，原来的antibody不认识了。
|
D****g
发帖数: 275 | 5 有可能，但是为啥呀？难道这个arginine 特别重要？看结构的话，似乎没那么重要的。
【在 y******m 的大作中提到】
: 转录后修饰被泛素酶降解？
|
g*****n
发帖数: 250 | |
D****g
发帖数: 275 | 7 只是把CGT 突变成了gGT, 没有产生stop codon. 不是stop codon 的问题。
【在 g*****n 的大作中提到】
: stop codon
|
m*****r
发帖数: 1164 | 8 有可能啊，说不定是意外的发现。感兴趣的话可以进一步摸索一下。你当初做这个突变
是为了做阴性对照吗？可以试试突变成别的跟Arg比较接近的氨基酸。
: 有可能，但是为啥呀？难道这个arginine 特别重要？看结构的话，似乎没那么
重要的。
【在 D****g 的大作中提到】
: 只是把CGT 突变成了gGT, 没有产生stop codon. 不是stop codon 的问题。
|
D****g
发帖数: 275 | 9 刚做了Arg->Lys 和 Arg->Ala, 不知会是啥结果
【在 m*****r 的大作中提到】
: 有可能啊，说不定是意外的发现。感兴趣的话可以进一步摸索一下。你当初做这个突变
: 是为了做阴性对照吗？可以试试突变成别的跟Arg比较接近的氨基酸。
:
:
: 有可能，但是为啥呀？难道这个arginine 特别重要？看结构的话，似乎没那么
: 重要的。
:
|
y******m
发帖数: 143 | |
g*c
发帖数: 68 | 11 加入突变后蛋白质折叠不变的话表面的氨基酸似乎怎么突变都无所谓。但是谁也不能保
证某种情况下这个氨基酸的突变一定不干扰折叠过程。 |
y******m
发帖数: 143 | 12 还有一个可能成为分泌蛋白，包内表达低都到细胞外了，当然不知道基因和序列情况下
这个想法有点异想天开，不过可以去查一下 |
D****g
发帖数: 275 | 13 这个可能性极低吧，这个蛋白的功能在细胞内，到细胞外就没啥用了。
【在 y******m 的大作中提到】
: 还有一个可能成为分泌蛋白，包内表达低都到细胞外了，当然不知道基因和序列情况下
: 这个想法有点异想天开，不过可以去查一下
|
D****g
发帖数: 275 | 14 这个Arg 在蛋白内部一个beta 折叠的一端，侧链靠近两个 alpha helixes, 会不会有
稳定蛋白结构的作用？
【在 g*c 的大作中提到】
: 加入突变后蛋白质折叠不变的话表面的氨基酸似乎怎么突变都无所谓。但是谁也不能保
: 证某种情况下这个氨基酸的突变一定不干扰折叠过程。
|
d****z
发帖数: 75 | |
g*****x
发帖数: 3283 | 16 啥叫“几乎全部消失”？proteomics做过了？
【在 D****g 的大作中提到】
: 最近构建了一个arg->gly突变体，本来是猜测这个arginine是一个酶切位点，结果突变
: 后，蛋白几乎全部消失了，而mRNA水平几乎没有变化。这个arginine以前没有啥报道，
: 看了下蛋白结构，也没发现有啥重大的做用。现在一点头绪都没有，大家有没有啥建议
: ？这可能是啥引起的？
: 🙏
|
c*******e
发帖数: 5818 | 17 好思路
：有可能啊，说不定是意外的发现。感兴趣的话可以进一步摸索一下。你当初做这个突
变是为了做阴性对照吗？可以试试突变成别的跟Arg比较接近的氨基酸。
： |
D****g
发帖数: 275 | 18 曝光稍短点，wt protein有很强的条带，突变体啥也看不到；长曝光后，wt protein
是一个很fat and strong band, 突变体只有一个很弱的细条；目测只有原来的 百分之
几。
【在 d****z 的大作中提到】
: 请教，啥叫消失了。表达不出来吗？？
|
D****g
发帖数: 275 | 19 发现突变成 Alanine 和突变成 glycine 结果一样，蛋白质很难被 western blot检测
到；突变成与Arg 类似带正电荷的lysine, 蛋白质也显著降低，但是比ala 和gly 高很
多；目测 如果wt 是100%，arg 突变体可能有10%，ala 和 gly的突变体 只有1%
【在 m*****r 的大作中提到】
: 有可能啊，说不定是意外的发现。感兴趣的话可以进一步摸索一下。你当初做这个突变
: 是为了做阴性对照吗？可以试试突变成别的跟Arg比较接近的氨基酸。
:
:
: 有可能，但是为啥呀？难道这个arginine 特别重要？看结构的话，似乎没那么
: 重要的。
:
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D****g
发帖数: 275 | 20 没做proteomics, 但是从蛋白质条带强度判断，只剩原来的1-2%
【在 g*****x 的大作中提到】
: 啥叫“几乎全部消失”？proteomics做过了？
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X*******8
发帖数: 3895 | 21 十有八九是如同有一位提到的泛素化降解了。证明这个很容易，加入泛素化抑制剂如
MG132或BORTEZOMIB看能不能检测到，或缩短表达时间入1-2小时等。
【在 D****g 的大作中提到】
: 最近构建了一个arg->gly突变体，本来是猜测这个arginine是一个酶切位点，结果突变
: 后，蛋白几乎全部消失了，而mRNA水平几乎没有变化。这个arginine以前没有啥报道，
: 看了下蛋白结构，也没发现有啥重大的做用。现在一点头绪都没有，大家有没有啥建议
: ？这可能是啥引起的？
: 🙏
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D****g
发帖数: 275 | 22 谢谢。准备用MG132试试。现在的表达时间是6个小时，担心再缩短时间 wt 蛋白的表达
也会变低很多,1-2小时会不会太短了？
【在 X*******8 的大作中提到】
: 十有八九是如同有一位提到的泛素化降解了。证明这个很容易，加入泛素化抑制剂如
: MG132或BORTEZOMIB看能不能检测到，或缩短表达时间入1-2小时等。
|
X*******8
发帖数: 3895 | 23 我有时用4小时。试试4-6小时，如果你认为1-2小时短了的话。一般做个time-course
【在 D****g 的大作中提到】
: 谢谢。准备用MG132试试。现在的表达时间是6个小时，担心再缩短时间 wt 蛋白的表达
: 也会变低很多,1-2小时会不会太短了？
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D****g
发帖数: 275 | 24 谢谢
【在 X*******8 的大作中提到】
: 我有时用4小时。试试4-6小时，如果你认为1-2小时短了的话。一般做个time-course
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e******n
发帖数: 193 | 25 求支持我们公司
www.biofargo.com
常规实验室耗材仪器 |
f*****e
发帖数: 34 | 26 期待楼主的updates。
【在 D****g 的大作中提到】
: 谢谢。准备用MG132试试。现在的表达时间是6个小时，担心再缩短时间 wt 蛋白的表达
: 也会变低很多,1-2小时会不会太短了？
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D****g
发帖数: 275 | 27 最近构建了一个arg->gly突变体，本来是猜测这个arginine是一个酶切位点，结果突变
后，蛋白几乎全部消失了，而mRNA水平几乎没有变化。这个arginine以前没有啥报道，
看了下蛋白结构，也没发现有啥重大的做用。现在一点头绪都没有，大家有没有啥建议
？这可能是啥引起的？
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r**********7
发帖数: 243 | 28 可能蛋白结构改变，原来的antibody不认识了。 |
y******m
发帖数: 143 | |
D****g
发帖数: 275 | 30 应该不会。用了flag tag antibody和另外两种蛋白特异antibodies，结果是一样的
【在 r**********7 的大作中提到】
: 可能蛋白结构改变，原来的antibody不认识了。
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D****g
发帖数: 275 | 31 有可能，但是为啥呀？难道这个arginine 特别重要？看结构的话，似乎没那么重要的。
【在 y******m 的大作中提到】
: 转录后修饰被泛素酶降解？
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g*****n
发帖数: 250 | |
D****g
发帖数: 275 | 33 只是把CGT 突变成了gGT, 没有产生stop codon. 不是stop codon 的问题。
【在 g*****n 的大作中提到】
: stop codon
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m*****r
发帖数: 1164 | 34 有可能啊，说不定是意外的发现。感兴趣的话可以进一步摸索一下。你当初做这个突变
是为了做阴性对照吗？可以试试突变成别的跟Arg比较接近的氨基酸。
: 有可能，但是为啥呀？难道这个arginine 特别重要？看结构的话，似乎没那么
重要的。
【在 D****g 的大作中提到】
: 只是把CGT 突变成了gGT, 没有产生stop codon. 不是stop codon 的问题。
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D****g
发帖数: 275 | 35 刚做了Arg->Lys 和 Arg->Ala, 不知会是啥结果
【在 m*****r 的大作中提到】
: 有可能啊，说不定是意外的发现。感兴趣的话可以进一步摸索一下。你当初做这个突变
: 是为了做阴性对照吗？可以试试突变成别的跟Arg比较接近的氨基酸。
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: 有可能，但是为啥呀？难道这个arginine 特别重要？看结构的话，似乎没那么
: 重要的。
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y******m
发帖数: 143 | |
g*c
发帖数: 68 | 37 加入突变后蛋白质折叠不变的话表面的氨基酸似乎怎么突变都无所谓。但是谁也不能保
证某种情况下这个氨基酸的突变一定不干扰折叠过程。 |
y******m
发帖数: 143 | 38 还有一个可能成为分泌蛋白，包内表达低都到细胞外了，当然不知道基因和序列情况下
这个想法有点异想天开，不过可以去查一下 |
D****g
发帖数: 275 | 39 这个可能性极低吧，这个蛋白的功能在细胞内，到细胞外就没啥用了。
【在 y******m 的大作中提到】
: 还有一个可能成为分泌蛋白，包内表达低都到细胞外了，当然不知道基因和序列情况下
: 这个想法有点异想天开，不过可以去查一下
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D****g
发帖数: 275 | 40 这个Arg 在蛋白内部一个beta 折叠的一端，侧链靠近两个 alpha helixes, 会不会有
稳定蛋白结构的作用？
【在 g*c 的大作中提到】
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: 证某种情况下这个氨基酸的突变一定不干扰折叠过程。
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d****z
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发帖数: 3283 | 42 啥叫“几乎全部消失”？proteomics做过了？
【在 D****g 的大作中提到】
: 最近构建了一个arg->gly突变体，本来是猜测这个arginine是一个酶切位点，结果突变
: 后，蛋白几乎全部消失了，而mRNA水平几乎没有变化。这个arginine以前没有啥报道，
: 看了下蛋白结构，也没发现有啥重大的做用。现在一点头绪都没有，大家有没有啥建议
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：有可能啊，说不定是意外的发现。感兴趣的话可以进一步摸索一下。你当初做这个突
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发帖数: 275 | 44 曝光稍短点，wt protein有很强的条带，突变体啥也看不到；长曝光后，wt protein
是一个很fat and strong band, 突变体只有一个很弱的细条；目测只有原来的 百分之
几。
【在 d****z 的大作中提到】
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发帖数: 275 | 45 发现突变成 Alanine 和突变成 glycine 结果一样，蛋白质很难被 western blot检测
到；突变成与Arg 类似带正电荷的lysine, 蛋白质也显著降低，但是比ala 和gly 高很
多；目测 如果wt 是100%，arg 突变体可能有10%，ala 和 gly的突变体 只有1%
【在 m*****r 的大作中提到】
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: 是为了做阴性对照吗？可以试试突变成别的跟Arg比较接近的氨基酸。
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: 有可能，但是为啥呀？难道这个arginine 特别重要？看结构的话，似乎没那么
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D****g
发帖数: 275 | 46 没做proteomics, 但是从蛋白质条带强度判断，只剩原来的1-2%
【在 g*****x 的大作中提到】
: 啥叫“几乎全部消失”？proteomics做过了？
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发帖数: 3895 | 47 十有八九是如同有一位提到的泛素化降解了。证明这个很容易，加入泛素化抑制剂如
MG132或BORTEZOMIB看能不能检测到，或缩短表达时间入1-2小时等。
【在 D****g 的大作中提到】
: 最近构建了一个arg->gly突变体，本来是猜测这个arginine是一个酶切位点，结果突变
: 后，蛋白几乎全部消失了，而mRNA水平几乎没有变化。这个arginine以前没有啥报道，
: 看了下蛋白结构，也没发现有啥重大的做用。现在一点头绪都没有，大家有没有啥建议
: ？这可能是啥引起的？
: 🙏
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D****g
发帖数: 275 | 48 谢谢。准备用MG132试试。现在的表达时间是6个小时，担心再缩短时间 wt 蛋白的表达
也会变低很多,1-2小时会不会太短了？
【在 X*******8 的大作中提到】
: 十有八九是如同有一位提到的泛素化降解了。证明这个很容易，加入泛素化抑制剂如
: MG132或BORTEZOMIB看能不能检测到，或缩短表达时间入1-2小时等。
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X*******8
发帖数: 3895 | 49 我有时用4小时。试试4-6小时，如果你认为1-2小时短了的话。一般做个time-course
【在 D****g 的大作中提到】
: 谢谢。准备用MG132试试。现在的表达时间是6个小时，担心再缩短时间 wt 蛋白的表达
: 也会变低很多,1-2小时会不会太短了？
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D****g
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发帖数: 193 | 51 求支持我们公司
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f*****e
发帖数: 34 | 52 期待楼主的updates。
【在 D****g 的大作中提到】
: 谢谢。准备用MG132试试。现在的表达时间是6个小时，担心再缩短时间 wt 蛋白的表达
: 也会变低很多,1-2小时会不会太短了？
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a******g
发帖数: 71 | 53 R有独特的和phosphate group形成H-bond的能力，比K强，比其他residue就不用说了。
你的蛋白是不是和nucleic acid或者membrane之类的有相互作用，并且这种作用起到了
stabilize这个蛋白的效果？ |
D****g
发帖数: 275 | 54 分析结构，发现这个arg 和asp 形成几个h-bonds, 很可能因此而起到了稳定结构的作
用。正在做mutants, 看看突变了相应的asp 后会不会有一样的效果
【在 a******g 的大作中提到】
: R有独特的和phosphate group形成H-bond的能力，比K强，比其他residue就不用说了。
: 你的蛋白是不是和nucleic acid或者membrane之类的有相互作用，并且这种作用起到了
: stabilize这个蛋白的效果？
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