v******0
发帖数: 265 | 1 大家好，上次我询问过关于HILIC column的一些问题，得到了不少帮助，但最近我又遇
到了一些问题，实在想不通，只好再来请教。
我打算分离鉴定一些phosphopeptide standard， 我先用C18做了LC-MS,大部分
phosphopeptide都可以看到明显的peak. 一些比较Hydrophilic的似乎peak很小，然后
我就用HILIC（Amide 80 HILIC) 去做,目的是检测这些Hydrophilic，浓度我调的和C18
的那个一样，不同的是C18就是water with 0.1% formic acid, HILIC用的是90%ACN，
10%water,0.1%formic acid. 我是先加了非常少的水（4ul)在sample里，然后又加了
36ul ACN。我sample量不多，所以不敢一上来加很多水去溶解。
我的结果就是用HILIC，几乎看不到什么peak, 理论上HILIC应该比C18要更有利于
phosphopeptide separation,特别是Hydrophilic的，但我却只能看到很小的几个peak,
大部分都消失了，而且也看不到Hydrophilic的peptide.
大家觉得我问题在哪呢？我感觉可能是我的sample根本没溶解，在C18里有40ul水所以
溶解了，HILIC里一上来只有4ul水，然后随便混混加了36ul ACN,这样是不是会对溶解
有影响呢？可是如果我上来就加40ul水，那得稀释到400ul才能使ACN达到90%，我看大
部分文献都是用90%以上的ACN去作为sample solution的，好像是为了使column可以
retain sample.
大家觉得我问题到底出在哪？
还有个问题就是我看文献上HILIC都会加ammonium salt,但我拿标准的peptide试验过（
4个peptide mix),至少我的data里没有什么质的差别，实在看不出有什么用，请问这个
ammonium salt到底有没有必要加呢？我这么问是因为每次加，就得换buffer,嫌麻烦，
到时候做C18又要换回来，而且salt多了，对ESI有影响，除非真的对HILIC有用，否则
想不通为什么大家都加这个，是不是我的peptide mix test不具有代表性。
对了，我这个peptide mix是用95% ACN溶解的，但不同的是这个先用了很多水去溶（因
为sample多），然后再稀释
不好意思，写得不算短，希望大家给我些建议，多谢了 | m**n
发帖数: 206 | 2 peptides sure will have different solubility in different solvent. If you
prepare sample in ACN, diluted sample (10time diluted than RPLC) and
increasing injection volume (10times injection of RPLC) will probably make
those peaks visible. | h*****t
发帖数: 1226 | 3 氨盐可以帮助分离, 而且也可以帮助提高酸性peptide的recovery
C18
peak,
【在 v******0 的大作中提到】
: 大家好，上次我询问过关于HILIC column的一些问题，得到了不少帮助，但最近我又遇
: 到了一些问题，实在想不通，只好再来请教。
: 我打算分离鉴定一些phosphopeptide standard， 我先用C18做了LC-MS,大部分
: phosphopeptide都可以看到明显的peak. 一些比较Hydrophilic的似乎peak很小，然后
: 我就用HILIC（Amide 80 HILIC) 去做,目的是检测这些Hydrophilic，浓度我调的和C18
: 的那个一样，不同的是C18就是water with 0.1% formic acid, HILIC用的是90%ACN，
: 10%water,0.1%formic acid. 我是先加了非常少的水（4ul)在sample里，然后又加了
: 36ul ACN。我sample量不多，所以不敢一上来加很多水去溶解。
: 我的结果就是用HILIC，几乎看不到什么peak, 理论上HILIC应该比C18要更有利于
: phosphopeptide separation,特别是Hydrophilic的，但我却只能看到很小的几个peak,
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