r**x 发帖数: 408 | 1 比方说有一个荧光分子,激发波长500nm发射波长550nm,将其标记在一个载体上之后,
这个载体在此激发波长处的散射强度太大了,把荧光的峰都遮盖住了,想问问各位高人
有没有什么办法能避免这个问题呢?我试了在比较短的波长处激发,比方说450nm,散
射峰还是很强以至于荧光的发射峰基本都看不见了。 |
f*******e 发帖数: 628 | 2 不明白你的问题。散射应该不会改变波长,荧光 filter 用的没错的话,荧光发射光对
比激发有波长变化,不会和散射有冲突。
用 450 即使可以激发,也不会改变荧光发射光谱波长,反而效率不高,更容易被遮盖。
散射有方向的话,可以避开散射强的方向测荧光。
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 比方说有一个荧光分子,激发波长500nm发射波长550nm,将其标记在一个载体上之后, : 这个载体在此激发波长处的散射强度太大了,把荧光的峰都遮盖住了,想问问各位高人 : 有没有什么办法能避免这个问题呢?我试了在比较短的波长处激发,比方说450nm,散 : 射峰还是很强以至于荧光的发射峰基本都看不见了。
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r**x 发帖数: 408 | 3 谢ls,这样说吧,比方说我的荧光分子激发波长是500nm,发射波长550nm,我在500nm
激发的时候,会得到500nm处的瑞利散射峰,由于我的载体比较大,导致这个散射峰非
常宽非常高,基本上覆盖了350-650nm,这样我就得不到荧光的真实值,因为你得到的是
散射和荧光叠加在一起的值,而且这个值主要是散射的。有啥办法可以扣除这个散射峰
强度吗? |
f*******e 发帖数: 628 | 4 还是之前说的,用对 filter 就好。
荧光有 stokes shift, raleigh scattering 没有,靠波长分开应该没问题。简单的
optics.
除非你用的是没经过 filter 的广谱激发光,不然不太可能出现覆盖整个可见光谱没办
法去除的情况。
flow cytometry 都是两者同时测的。
500nm
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢ls,这样说吧,比方说我的荧光分子激发波长是500nm,发射波长550nm,我在500nm : 激发的时候,会得到500nm处的瑞利散射峰,由于我的载体比较大,导致这个散射峰非 : 常宽非常高,基本上覆盖了350-650nm,这样我就得不到荧光的真实值,因为你得到的是 : 散射和荧光叠加在一起的值,而且这个值主要是散射的。有啥办法可以扣除这个散射峰 : 强度吗?
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r**x 发帖数: 408 | 5 再谢,那FILTER是指荧光仪自带的FILTER还是需要再买其他的外置的? |
K****l 发帖数: 861 | 6 不太懂的弱问一句:
如何确定350-650的散射峰不是发射峰?
500nm
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢ls,这样说吧,比方说我的荧光分子激发波长是500nm,发射波长550nm,我在500nm : 激发的时候,会得到500nm处的瑞利散射峰,由于我的载体比较大,导致这个散射峰非 : 常宽非常高,基本上覆盖了350-650nm,这样我就得不到荧光的真实值,因为你得到的是 : 散射和荧光叠加在一起的值,而且这个值主要是散射的。有啥办法可以扣除这个散射峰 : 强度吗?
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o****e 发帖数: 1011 | 7 longpass filter
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 再谢,那FILTER是指荧光仪自带的FILTER还是需要再买其他的外置的?
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v*****s 发帖数: 20290 | 8 不好弄,你的这个散射峰其实已经未必是瑞利散射峰了。如果你光谱仪的入射角没有问
题,或者说真的在550nm有这个wing,那什么filter都滤不掉,因为本身频率就一样,
怎么滤?当然保险起见,先上至少两个530的ultra-steep long-pass filter再说,最
好是有两个notch filter。
比较有希望的办法是在入射样品之前,上narrow band-pass filter把你的laser line
好好滤滤。diode laser本身的频谱经常比较宽,你不注意看不出来,但是用来测弱荧
光和拉曼的时候很容易淹没信号。
或者就是数据处理的时候,想点办法,因为荧光应该是个相对比较窄的峰,散射峰的
wing是比较平缓的基线。
最后的办法就是换载体吧,搞不好你的载体本身有比较强的raman continuum或者
photoluminescence(不过那样的话,不太可能下延到350nm)。
500nm
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢ls,这样说吧,比方说我的荧光分子激发波长是500nm,发射波长550nm,我在500nm : 激发的时候,会得到500nm处的瑞利散射峰,由于我的载体比较大,导致这个散射峰非 : 常宽非常高,基本上覆盖了350-650nm,这样我就得不到荧光的真实值,因为你得到的是 : 散射和荧光叠加在一起的值,而且这个值主要是散射的。有啥办法可以扣除这个散射峰 : 强度吗?
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r**x 发帖数: 408 | 9 我这个载体是NONPOROUS SILICA,12nm,表面积200m2/g,上面生长了一些高分子,我先
后做了好几个样,都是在激发的时候,比方说500nm激发,瑞利散射的峰都超过了量程
(1000),但是荧光也才是不到100,我要是多LABEL一些荧光上去的话有用吗? |
r**x 发帖数: 408 | 10 发射峰是个比较窄的峰,应该出现在它的发射波长处。
【在 K****l 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不太懂的弱问一句: : 如何确定350-650的散射峰不是发射峰? : : 500nm
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o****u 发帖数: 1299 | 11 try notch filter @500nm.
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 比方说有一个荧光分子,激发波长500nm发射波长550nm,将其标记在一个载体上之后, : 这个载体在此激发波长处的散射强度太大了,把荧光的峰都遮盖住了,想问问各位高人 : 有没有什么办法能避免这个问题呢?我试了在比较短的波长处激发,比方说450nm,散 : 射峰还是很强以至于荧光的发射峰基本都看不见了。
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m********3 发帖数: 2125 | 12 找stoke shift>150 nm, 发光效率高的荧光分子。 |
r**x 发帖数: 408 | 13 请问哪一家的NOTCH FILTER效果比较好啊?谢谢
【在 o****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : try notch filter @500nm.
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r**x 发帖数: 408 | 14
【在 m********3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 找stoke shift>150 nm, 发光效率高的荧光分子。
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r**x 发帖数: 408 | 15 有没有啥能和amine标记的荧光分子,STOCK SHIFT比较大的?我现在用alexa系列的,
STOCK SHIFT一般才十几二十的样子。
【在 m********3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 找stoke shift>150 nm, 发光效率高的荧光分子。
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f*******e 发帖数: 628 | 16 alexa dyes r the best out there. when it comes to fluorescent dyes, you don'
t have much choice of stokes shift.
if you need that big Stokes shift for sure, quantum dots are your only hope.
but i don't believe it is the case in your initial problem.
check your fluoremeter setup. make sure you are using the correct settings
including illumination and filters.
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有没有啥能和amine标记的荧光分子,STOCK SHIFT比较大的?我现在用alexa系列的, : STOCK SHIFT一般才十几二十的样子。
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p*l 发帖数: 1359 | 17 If your sample is highly scattering, you need to add filters. Filters only
work when the light is normal to the surface within +-5 degree. Make sure
your filters is located in the path where the light is collimated.
Semrock has good filters.
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我这个载体是NONPOROUS SILICA,12nm,表面积200m2/g,上面生长了一些高分子,我先 : 后做了好几个样,都是在激发的时候,比方说500nm激发,瑞利散射的峰都超过了量程 : (1000),但是荧光也才是不到100,我要是多LABEL一些荧光上去的话有用吗?
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m********3 发帖数: 2125 | 18 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D1199
Di-4-ANEPPS
there is a big stoke shift (150-200 nm).
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有没有啥能和amine标记的荧光分子,STOCK SHIFT比较大的?我现在用alexa系列的, : STOCK SHIFT一般才十几二十的样子。
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r**x 发帖数: 408 | 19 这个LABEL起来不如那些succinimidyl ester方便啊,不明白是怎么LABEL上去的。 |
m********3 发帖数: 2125 | 20 这个有succinimidyl ester 版本的,不过不在市场上。
看下面的参考文献。
Neuron, Vol. 37, 85–97, January 9, 2003, Copyright 2003 by Cell
Press
你要的话需要跟corresponding author联系。
【在 r**x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个LABEL起来不如那些succinimidyl ester方便啊,不明白是怎么LABEL上去的。
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