m**1
发帖数: 2 | 1 我想用Lentivirus介导针对某一基因ShRNA感染U2OS细胞以Knockdown该基因的表达，结
果是反复几次均未成功----感染U2OS细胞后用Puromycin筛选，细胞全部死亡。这说明
可能1）Lentivirus没有包装成功2）U2OS对Lentivirus敏感3）----？
我有该种Lentiviral表达质粒直接用Fugene
6转染U2OS细胞，然后用puromycin
筛选，有大部分细胞survival,说明Lentiviral表达质粒没有问题。
我包装Lentivirus的过程是：
Co-transfect下列质粒至 293T 细胞（用Fugene
6），48小时后，将上清液过滤，直接加到U2OS细胞上，48小时后加入Puromycin进行筛
选。
Lentiviral质粒 5ug
Gap 2ug
Rev 2ug
VSVG 2ug DNA总量 11ug, Fugene reagent 33ul.
第二次加大了DNA量，但还是不成功。
Lentiviral 质粒 10ug
Gap 3ug
Rev 3ug
VsVG 3ug DNA 总量19ug,Fugene 57 |
s******u
发帖数: 81 | 2 似乎你的“感染”方法效率不高，可以试试concentrate virus, 然后转染with
polybrene提高转染效率
【在 m**1 的大作中提到】
: 我想用Lentivirus介导针对某一基因ShRNA感染U2OS细胞以Knockdown该基因的表达，结
: 果是反复几次均未成功----感染U2OS细胞后用Puromycin筛选，细胞全部死亡。这说明
: 可能1）Lentivirus没有包装成功2）U2OS对Lentivirus敏感3）----？
: 我有该种Lentiviral表达质粒直接用Fugene
: 6转染U2OS细胞，然后用puromycin
: 筛选，有大部分细胞survival,说明Lentiviral表达质粒没有问题。
: 我包装Lentivirus的过程是：
: Co-transfect下列质粒至 293T 细胞（用Fugene
: 6），48小时后，将上清液过滤，直接加到U2OS细胞上，48小时后加入Puromycin进行筛
: 选。
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y*******i
发帖数: 96 | 3 用fugene 6能转染成功为什么还要包装成病毒，再去感染细胞呢，我真的不懂，很想知
道答案．多谢！ |
m**1
发帖数: 2 | 4 因为Lentivirus感染U2OS cells的效率高，~ 98%; 而Fugene转染效率为~70%.因为我最
后的实验要用FACS来做，所以我希望几乎所有的细胞多能感染。
【在 y*******i 的大作中提到】
: 用fugene 6能转染成功为什么还要包装成病毒，再去感染细胞呢，我真的不懂，很想知
: 道答案．多谢！
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