d****i
发帖数: 2346 | 1 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
protease还能用于western？ |
d****i
发帖数: 2346 | 2 同时再问一个问题：
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？ |
d****i
发帖数: 2346 | 3 同时再问一个问题：
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？ |
y****i
发帖数: 2194 | 4 温度是关键，一定要迅速降温，整个组织先扔到ice cold pbs里面冷却
然后再捞出来上lysis buffer
要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上
【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western？
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y****y
发帖数: 123 | |
i***l
发帖数: 1656 | 6 3-4M urea
without SDS otherwise homogenization generates tons of bubbles which are
what you do not want.
i'd discard samples left at RT due to degradation. |
s******y
发帖数: 28562 | 7
8M urea?
【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western？
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z*********8
发帖数: 1203 | 8 我做过这个实验，用液氮ground tissue，然后加点buffer，直接hypotonic lysis了，
感觉效果还可以，不过我整体感觉tissue尤其是gut里面protease， RNAase都比较高。 |
d****i
发帖数: 2346 | 9
我是从液氮里直接拿出来的，扔进lysis buffer。。。
【在 y****i 的大作中提到】
: 温度是关键，一定要迅速降温，整个组织先扔到ice cold pbs里面冷却
: 然后再捞出来上lysis buffer
: 要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
: 还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上
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d****i
发帖数: 2346 | 10
确实有很多泡泡，很烦人。
3-4M urea会不会太高了？
【在 i***l 的大作中提到】
: 3-4M urea
: without SDS otherwise homogenization generates tons of bubbles which are
: what you do not want.
: i'd discard samples left at RT due to degradation.
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d****i
发帖数: 2346 | 11
你的意思是先研成干粉，然后加lysis buffer？
【在 z*********8 的大作中提到】
: 我做过这个实验，用液氮ground tissue，然后加点buffer，直接hypotonic lysis了，
: 感觉效果还可以，不过我整体感觉tissue尤其是gut里面protease， RNAase都比较高。
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d****i
发帖数: 2346 | 12
里面没有urea啊。。。。。
【在 s******y 的大作中提到】
:
: 8M urea?
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s******y
发帖数: 28562 | 13 以前我都是这么做的。先在液氮浸泡里磨成干粉，然后直接加lysis buffer煮了。
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 里面没有urea啊。。。。。
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i***l
发帖数: 1656 | 14 i am telling you the trick i used
you are questioning me about my trick
what do you want to hear from me?
before asking"3-4M urea会不会太高了" have you check why use urea and what's
the usual range of urea used in denaturing buffer?
what's the conc. you think is better?
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 里面没有urea啊。。。。。
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D**A
发帖数: 311 | 15 protease inhibitor 加够推荐的量就可以，多加浪费钱，效果还不一定好，可以加点
PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
glycerol.
先用液氮冷，然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
蛋白在室温下过夜会水解。
能想到的就这么多了。 |
d****i
发帖数: 2346 | 16
非常感谢！我也是实在没办法，多加了inhibitor。PMSF也加了。
加了inhibitor的lysis buffer放在冰里遇冷，然后从液氮里拿出tissue，立即
homogenize。。。。
我说的室温过夜是加了6xloading buffer，另外我的buffer里还有2%的SDS，这样也会
降解吗？
【在 D**A 的大作中提到】
: protease inhibitor 加够推荐的量就可以，多加浪费钱，效果还不一定好，可以加点
: PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
: glycerol.
: 先用液氮冷，然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
: 蛋白在室温下过夜会水解。
: 能想到的就这么多了。
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h*******o
发帖数: 4884 | 17 我个人感觉用液氮snap freeze以后直接pulverize的效果最好 顺手还可以分成aliquot
然后-80保存， 以后要homogenize 的时候拿出来直接加lysisbuffer
放bullet blender 放在冰柜里面打， 打完以后至少放冰上
protease inhibitor用多了没有什么额外作用 |
c********b
发帖数: 363 | 18 上点MG132或者MG115？
【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western？
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