K**********e
发帖数: 188 | 1 前两天有人问过，但是没人回答。我也有这个问题。
跟蛋白有关的buffer里面的盐，多数时候是NaCl，但是nuclear extract经常用KCl，这是为什么呢？
也常常加1mM 的Mg，不过Mg不是protease需要的吗，会不会导致蛋白降解？
更疑惑的是还有同时加Mg和EDTA的，EDTA不是chelate二价离子吗，这样的话不是互相取消了吗。EDTA的目的是什么
呢？
有时候加1mM DTT在buffer里面，有时候又加beta 巯基乙醇。这有什么区别呢？
盼回答。谢谢。 |
j********r
发帖数: 156 | 2 I suppose no much difference between KCl and NaCl. But if you do some
functional assay, you might prefer KCl, which is more physiological. One
disadvantage of using KCl is that if you run SDS-PAGE, the potassium form of
SDS will precipitate (by the same token, the buffer 3 in plasmid DNA kit
usually includes KOH but not NaOH) at room temperature, which might cause a
little trouble for loading.
As to Mg++, it is required for metalloproteinase as well as for many
functional enzymes in the cell. St |
g*****y
发帖数: 6325 | 3 DTT 和B-ME都是起还原作用。防止2硫键。 但是各有优缺点。 DTT在室温和4oC都不稳
定。 大概有效时间是1天。 b-
ME稳定，但是还原能力比DTT弱。 DTT和b-ME都很难闻。 现在有的实验室用TCEP. 还原
能力强，又稳定无色无味。 但
是价格高。 所以都是随个人喜好和经济实力来选择。
这是为什么呢？
相取消了吗。EDTA的目的是什么
【在 K**********e 的大作中提到】
: 前两天有人问过，但是没人回答。我也有这个问题。
: 跟蛋白有关的buffer里面的盐，多数时候是NaCl，但是nuclear extract经常用KCl，这是为什么呢？
: 也常常加1mM 的Mg，不过Mg不是protease需要的吗，会不会导致蛋白降解？
: 更疑惑的是还有同时加Mg和EDTA的，EDTA不是chelate二价离子吗，这样的话不是互相取消了吗。EDTA的目的是什么
: 呢？
: 有时候加1mM DTT在buffer里面，有时候又加beta 巯基乙醇。这有什么区别呢？
: 盼回答。谢谢。
|
K**********e
发帖数: 188 | |
v***a
发帖数: 1242 | 5 就我的理解（包括从网上抄的）：
EDTA是：
1）蛋白质变性剂和稳定剂。
2）金属鏊合剂，螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子（防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防
止Mg2+离子与核酸生成沉淀），抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需
要一定的金属离子作辅基）。
3）有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
【在 K**********e 的大作中提到】
: 谢谢上面的两位。
: EDTA又有什么作用呢？
|
K**********e
发帖数: 188 | 6 汗，你说的这3个作用，跟蛋白buffer需要加，除了蛋白质稳定剂那一条，很多地方都
是矛盾啊。
EDTA是怎么使蛋白质稳定的？ |
l****o
发帖数: 58 | |
g*****y
发帖数: 6325 | 8 我们实验室的bacteria lysis buffer 很简单。就是tris-hcl 加 10mM EDTA. 加EDTA
是为了抑制protease 。EDTA和
mg++的结合比ca2+要弱， 加EDTA-Mg, mg会和ca交换。 最终是ca++结合EDTA
【在 K**********e 的大作中提到】
: 汗，你说的这3个作用，跟蛋白buffer需要加，除了蛋白质稳定剂那一条，很多地方都
: 是矛盾啊。
: EDTA是怎么使蛋白质稳定的？
|
b****T
发帖数: 134 | 9 you can get most of the answers from google. (this is waht i do.)
or talk to your chemistry friends. |
