n***3
发帖数: 663 | 1 thanks, but where can I buy that antibody? Link?
Thanks a lot! |
|
v***a
发帖数: 1242 | 2 我在研究一个蛋白，它是一个跨膜蛋白，有胞外域和胞内域两个部分（见附图，在2楼
）。胞外域和胞内域在某种信号的介导下，会被一切两段，胞外域的那一段就会从细胞
表面上脱落，游离到体液（in vivo）或培养液（in vitro）中（不过也有可能掉回细
胞内出现在tissue/cell lysate中？）；而胞内域的那一段（包括跨膜域）就残留在细
胞膜上。
最初做in vivo时，我买了两个单克隆抗体（当时还不知道这个蛋白会被一切两段），
它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band（IB），
后来又买了两个多克隆抗体，可以检测出一条符合预期的band，以及那条上面的单抗可
以检测出的较短的band。然后又查了文献，猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
缘故。
两个单抗都是raised against此蛋白的胞外域，而两个多抗是against胞内域。但是不
清楚为什么单抗就检测不出full length的蛋白（现在想可能因为mAb无法识别full
length的conformation？大家觉得这个猜测对吗？）
现在开始做in vitro的细胞培养， |
|
l***d
发帖数: 1828 | 3 有遗漏和错误的请大家补充
物理:
1985年, 发现量子霍尔效应,80年发现, 5年
1986年, 扫描隧道显微镜, 81年的工作, 5年
1987年, 高温超导, 86年发现, 才1年!
2001年, 玻色-爱因斯坦凝聚态, 95年的工作, 6年.
2010年, 石墨烯材料, 2004年的工作, 6年.
生理学或医学奖
1984年, 单克隆抗体, 75年的工作, 9年.
2006年, RNA干扰, 98年的工作, 8年.
化学奖:
1988年, 光合作用中心的三维结构, 82-85的工作, 3-6年
1989年, 核糖核酸（RNA）催化性质的发现, 82年的工作, 7年.
1993年, PCR, 85年的工作, 8年.
1997年, 三磷酸腺苷合成酶, 94年的工作, 3年.
2003年, 离子通道的研究, 98年的工作, 5年.
2006年, 真核转录的分子基础, 2001年工作, 5年.
2009年, 核糖体结构, 2000年工作, 9年.
虽然化学有7项，但全是生物化学的，传统意义上的化学一个都没有，其实可以和医学
奖算一类，这样一共9项，其中5项都是结构。 |
|
z**********8
发帖数: 766 | 4 谢谢各位参与讨论!
我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
PCR再酶切的方法去筛.
我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
帖了.
回到问题,我有些奇怪的猜测,希望遗传朋友或懂测序的朋友指点.
1)有无可能有些肿瘤细胞出现三倍体? 有些细胞仍正常.
2)若突变细胞只是所有细胞一部分,会否导致缺失突变被测序时,两条链高低不等? 可相
差几倍吗? 一般的概念是等峰,我有些突变是这样.可还有些总是测序FASTA峰值差很多.
是否是因为突变的细胞比例低所致?
谢谢! |
|
f********n
发帖数: 6465 | 5 猴儿会用显微镜?
生物的绝大多数工作都不是人干的.
例如我原来同时制备10个质粒单克隆的稳定转染细胞系.
每个细胞系都要做好几盘细胞筛选,总共好几十盘细胞.
光换MEDIUM都要好几个小时,我都是一边做实验一边含泪哭.
为什么我的命会这么苦,现在想想捞晶体的什么的,都是很辛苦.
因为生物绝大多数工作都不是人干的. |
|
C********f
发帖数: 173 | 6 单纯技术而言，也不是你说的那么简单的，你做抗体或者建立library之类我觉得技术
含量其实不算很高，就是把国外实验室相关技术copy就可以了，技术屏障也不大
高端仪器也不仅仅是几个部件的问题，并不是需要多花钱就一定能做好的
电子通讯这个领域，中国现在是领先的，而且中国的市场很大，把渠道做起来我觉得本
身驱动的动力就很大。国内科研经费的投入和欧美比较差距还是很大的。单纯全中国的
市场，我觉得也不见得比欧洲一个小国的成熟市场大。中国真正在做生物医学科研的地
方也不过是集中在几个大城市和好大学研究所而已。清华医学院的实验室比国外一个医
学院实验室还是少很多了。
即便是一年200万科研经费的实验室，20到30万美元在国外人多的实验室开工资都不够。
我在国外的实验室光单克隆抗体就500多个，买几百块的beads，一买就是5个，一次就
可以用掉三个。2000块的kit，大规模做实验，几次就用完了。国内可以吗？ |
|
m*****n
发帖数: 421 | 7 新药专家刘日廷博士谈：中国创新新药的发展与模式
来源 《中国医药技术经济与管理》
记者：谢谢您接受采访，首先请介绍一下您在新药及生物技术领域的教育背景与研发经
验。
刘日廷：我是临床医学出身，1989年经广州医学院和中山医科大学连读获医学硕士。毕
业后在西安杨森制药公司当了三年多的地区销售经理。中国医药界说西安杨森是中国医
药营销的黄埔军校。按这种说法，我就是“黄埔一期”的了（笑）。这些市场营销经验
，对增强我在新药立项研究方面的能力具有重要的意义。
1993年，我到了美国纽约医学院免疫系作为访问研究员从事抗肿瘤单克隆抗体的开发工
作。之后在美国德州大学/安德森癌症中心（全美排第一的肿瘤中心）攻读生化博士。
其间，值得自豪的是我成为了世界上首先发现脑谜脂（Psychosine）引起钙离子细胞内
释放的科学家。当时，世界上十个国家（包括美国、日本、法国、德国、瑞士、澳大利
亚、意大利等）二十多名著名科学家曾写推荐信给美国政府，赞扬本人所作的研究贡献
，美国政府以“国家利益豁免”，授予本人快速获取美国绿卡的特权。接着，我随导师
到了达拉华大学进行博士后研究，之后，又到了美国礼来公司总部担任... 阅读全帖 |
|
s******r
发帖数: 2876 | 8 NIW，还不是EB1，
哪一个千老不能NIW？
新药专家刘日廷博士谈：中国创新新药的发展与模式
来源 《中国医药技术经济与管理》
记者：谢谢您接受采访，首先请介绍一下您在新药及生物技术领域的教育背景与研发经
验。
刘日廷：我是临床医学出身，1989年经广州医学院和中山医科大学连读获医学硕士。毕
业后在西安杨森制药公司当了三年多的地区销售经理。中国医药界说西安杨森是中国医
药营销的黄埔军校。按这种说法，我就是“黄埔一期”的了（笑）。这些市场营销经验
，对增强我在新药立项研究方面的能力具有重要的意义。
1993年，我到了美国纽约医学院免疫系作为访问研究员从事抗肿瘤单克隆抗体的开发工
作。之后在美国德州大学/安德森癌症中心（全美排第一的肿瘤中心）攻读生化博士。
其间，值得自豪的是我成为了世界上首先发现脑谜脂（Psychosine）引起钙离子细胞内
释放的科学家。当时，世界上十个国家（包括美国、日本、法国、德国、瑞士、澳大利
亚、意大利等）二十多名著名科学家曾写推荐信给美国政府，赞扬本人所作的研究贡献
，美国政府以“国家利益豁免”，授予本人快速获取美国绿卡的特权。接着，我随导师
到了达拉华大... 阅读全帖 |
|
w*****n
发帖数: 310 | 9 你挑单克隆,想要什么样的结果都能做到.stable cell line应该用来做pathway看上下
游protein的变化。
proliferation
transient |
|
d******1
发帖数: 709 | 10 别把疯牛病和其他病相提并论，至今疯牛病的传染机制还不清楚。Amyloid是病因还是
附带的症状都不清楚。况且又不能通过空气传播。再说你也太小看免疫系统了，有空多
研究一下单克隆抗体药物。那个抗老年痴呆的抗体，可惜最后没通过临床。 |
|
g*********r
发帖数: 9366 | 11 我个人贡献两个方向
单克隆抗体实际设计制造
fermentation
消息 |
|
d*******e
发帖数: 110 | 12 听说Yang Xu博士在国内开了个生物医药公司，搞得风生水起，简历上还写着：1980年
考入浙江大学医学院临床医学专业学习，1985年毕业于医学院获学士学位。
1990年考入美国康奈尔大学医学院肿瘤分子生物学专业学习，1994年毕业于美国康奈尔
大学医学院获博士学位；1995年1月～2000年1月：在美国史隆凯特林肿瘤研究所担任研
究员、教授，他与指导老师一起
在国际上首次创立人类单克隆抗体-CD33，该抗体也是美国FDA首次批准的白血病治疗药
物。如果是真的话，挺牛的。 |
|
s*********t
发帖数: 600 | 13 科学朝代的兴衰：哈佛一个系科的故事
回顾科学史上一个学科、一个系科、一个团队的兴衰，不仅有趣、也引人思考：未来的
发展可以吸取哪些经验教训？
生物学一个突出的例子是英国医学研究委员会支持的分子生物学实验室，开创了分子生
物学、发明了广泛应用的单克隆
抗体、出现13个诺贝尔奖获得者…。
如此灿烂的科学朝代，也有消长：有时是自然消长，有时是外界变化，有时是自大顽固
，有时是杰出的科学家行政能力
很糟糕，有时是经验总结错误（把成功过程发生过的都误认为是成功的原因）…
我自己的专业神经生物学，西班牙的卡哈尔（Santiago Ramón y Cajal, 1852-1934，
诺贝尔1906）公认为现代神经
生物学之父；英国的伦敦、剑桥、牛津等大学对神经生物学、特别是神经生理学有突出
贡献；美国的霍普金斯大学、华
盛顿大学长期有很强的神经生物学传统，其中华盛顿大学1920到1930年代在神经传导的
工作为美国获得第一次神经生
物学诺贝尔奖（1944）、1950到1960年代发现神经生长因子的工作（1986获得迄今唯一
的神经发育的诺贝尔奖）奠
定其长期在神经发育研究方面领先世界、1980年代领... 阅读全帖 |
|
m*********n
发帖数: 215 | 14 重新转化，挑单克隆然后测序。如果你的插入序列是pcr来的话，测序需要设计primer
把插入序列的全场都测过。还有你用的细胞系内源表达此担保么？ |
|
R*9
发帖数: 15 | 15 主要取决于你的实验目的。举两个例子：
如果你想做克隆，用来表达蛋白，转基因什么的，当然要先克隆再测序了。因为PCR会
导入很多突变，你只有挑选正确的PCR序列才能进行下游的研究。
如果你用来genotyping,那么PCR产物用来测序比克隆要好，因为PCR是一个混合物，通
常对于一个位点，正确的远远大于变异的，那么当你测序的时候，那个变异的信号就被
覆盖了，只有真正的来自基因组/cDNA的变异（SNP或者突变）不会被覆盖，而且你很容
易通过测序结果看出杂合子来（双峰），要达到这些效果你要是测单克隆的质粒的话要
测好几个，费钱，费时，费力，估计没人会去做。 |
|
s*********y
发帖数: 1189 | 16 请问你试过的两种Ab 都具体是什么公司的，Cat# 是什么？我个人觉得单克隆的可能会
好一点。 |
|
a******7
发帖数: 7936 | 17 单细胞都怎么抓的？
是单克隆么？
我用trypsin消化了数一下浓度，然后0.2cell/well种到96孔板里，过一天检查，只留
有一个细胞的孔。 |
|
z********i
发帖数: 610 | 18 可以试试zymed的pSer（现在是invitrogene），purified的多抗，运气好的话能找到一
个好用的。我们买过好几只，其中有很好用的。
sigma的pSer是单抗，信号很弱可以用。
pY很好用，那是因为都是同一个单克隆细胞株，不同的公司名称可能不一样。 |
|
e********r
发帖数: 353 | 19 1, 原发性肝癌从诊断确诊后生存期只有6个月，因此病人从此是在与死神赛跑。
2，国内干细胞治疗很不规范，而且主要是由一些特殊的医院在干的。
3，国内正规的大学没有这么乱的，但是他们由于众所周知的原因也不知道如何做干细
胞治疗。我们的合作进行中。
4，原发性肝癌在中国趋向于中青年人群。形势很严峻。
5，你的德国人的报道，已经证明了在技术上的成功。主要的技术多在上面，因为病人
如能存活6个月以上已经不得了了。
6。干细胞移植加手术，化疗完全可以延长肝癌病人的生存期。这是毫无疑问的了，而
且现在我们有了更好的技术方法。
7，你的外公有了年纪（?),又有了多脏器转移，时间不多了。
8，我知道国内有医院用同位素标记的单克隆抗体治疗晚期肝癌。不知有用否？
我不是美国医生，以上仅供参考，不是专业建议。 |
|
s*****g
发帖数: 7857 | 20 转染,挑单克隆 是对的.
但只要培养就要加抗生素时刻筛选.(除了做实验时候,撤抗生素.)--"一定不能中断选择药物" |
|
f********s
发帖数: 115 | 21 96孔板每一个孔就是200ul 培养基，最后把这200ul全部吸出来，细胞全部离心到slide
上面，然后染色就可以看到子细胞的形态。在这种情况下，不靠细胞集落的形态分析，
直接看每一个细胞的形态，根据形态可以判断子细胞的类型。
根据细胞集落的形态，颜色，大小来判断progenitor的分化对于wildtype还比较可靠，
对于mutant来说不可靠，各种不正常都可能发生。最后还是需要挑单克隆，看细胞来进
一步验证。 |
|
b******s
发帖数: 1089 | 22 我以前三个片段反应的时候也遇到大量假阳性问题。但是单个片段的反应效率和特异性
应该很高。可能性有很多很多。但是与其花时间另一个个的试验，不如从头开始：
重新转化entry clone和destination clone，验证单克隆，然后提质粒。很多
destination vector放久了据说容易出问题。重新做平板，立刻用。37度过夜不要超过
16hr..... |
|
M**a
发帖数: 4816 | 23 RT.有2个蛋白想用单抗来检查表达情况，唯一要求是质量有保证，谢谢！ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 24 单抗的质量很容易保证的，因为有非常容易的检验方法。
我们都是用中国和台湾的那几个公司，动作快，价格低。 |
|
|
|
D******9
发帖数: 2665 | 27 covance is the best one |
|
|
t****p
发帖数: 1504 | 29 我们试了一个当地的公司，白等了三四个月抗体，两只GP都不work；后来花了10倍价在
Covance做了两只，一只极好，一只跟小公司的差不多。后来算了笔账，还是觉得应该
直接用Covance的。在美国，实验室劳力比东西贵多了。 |
|
|
D******9
发帖数: 2665 | 31 Covance只用ELISA做检测， 但是确实有保证， 就是价格贵一些 |
|
|
a*******a
发帖数: 4233 | 33 同一strain的老鼠也有variation啊
我当时的想法是建一个es系、挑单克隆出来一半存了，
另一半诱导分化成终末分化细胞然后再ips
不过中间还有好几个技术问题
而且epigenome variation必然很大。。 |
|
|
c****g
发帖数: 93 | 35 基本差不多，单克隆当时挑多了，现在keep cells 能把人搞疯，还要set up cell做
western blot。。。 |
|
c**********e
发帖数: 70 | 36 请问你所说的做metagenomics之前做一个pyrotag的trial，看看是不是值得做
metagenomics，有什么参考文献吗？
我们最早的是PCR-单克隆-sanger，后来是PCR-454， 目前在考虑是不是做meta，因为
PCR的区域似乎不能提供我们希望的resolution，你所说的评价是否做meta是怎么一回
事啊？ |
|
n**a
发帖数: 212 | 37 做了一个knock-in construct，全长13kb的genomic DNA, 单克隆，maxi-prep , 酶切
都是正确的，送去测序却20个引物只能有6个正常测序，其他要么扩增奇短，要么不反
应，要么杂峰。
大家给看看，是不是genomic DNA测序有什么要注意的？多谢! |
|
p********e
发帖数: 61 | 38 看了大家的回帖，很受感动。大家确实给了很多宝贵意见（只有一个例外）。总结一下
大家的意见和我的想法。
1. 如何真正实现供货，后勤，销售和市场营销等
这个我确实考虑了很多。我觉得基本上都搞定了。不过我还没有正是开始，不知道到时
会不会有新的问题产生。有一位有经验的大哥告诉我：遇到问题学会去解决就是了，你
们做科研难道不是每天都在解决新问题吗？我觉得这位大哥很在理，也很感激他。
2. 中国进货质量
生物试剂和电子产品一样，其实大多数都是中国生产。只不过贴了Invitrogen, Sigma
之类的标而已。我要做的都不是什么前沿试剂，都是常用的试剂，制造方法十分成熟。
比如单克隆抗体，Marker, Plasmid kit等，能有什么质量问题？大家去查一查AbCam的
单抗，看一看TDS,你会发现很多都与国内的某些小公司一模一样，原因在于它们来自于
国内的公司，只不过贴了AbCam的标而已。
关键还是在于我们对供货商的质控。我其实已经有很多供货商了。我本人以及一些朋友
正在做测试。如果过关我们才会贴到我网站上。（这就是为什么我网站上只有产品类别
而暂时还没有产品的原因）
不过如... 阅读全帖 |
|
d*p
发帖数: 534 | 39 最简单办法，转化，稀释，挑单克隆测序，测100个， 看 比率 |
|
d*p
发帖数: 534 | 40 最简单办法，转化，稀释，挑单克隆测序，测100个， 看 比率 |
|
j*******e
发帖数: 23 | 41 Postdocs
Multiple postdoctoral positions are available in Dr. Jiankui He’s
laboratory in South University of Science and Technology of China (SUSTC).
Dr. He is building up the Genome Center at SUSTC, with the most advanced
high throughput sequencers such as Illumina Hiseq, Miseq, Ion Torrent and
Roche 454. We are initiating an international collaborative study “The
International Human Immunome Project”. The International Human Immunome
Project aims to sequence the immune repertoire of 10,000 pat... 阅读全帖 |
|
j******1
发帖数: 1315 | 42 理论上应该挑单克隆的细胞 3-4个，鉴定后再mix在一起。当然，大家都是能用就好了
，很少有人真这么做。 |
|
v*********d
发帖数: 382 | 43 Ectopic expression 经过几代后很容易就被silence掉了。
你的construct 如果是transient expression, 有没有GFP? 如果有
1，你现在的细胞株可以试一下染色，看看能不能检测到
2，从新做, 挑有GFP的单克隆， 再做个western 看看对不对 |
|
y******8
发帖数: 1764 | 44 pacbio的单分子相互必须有一定的距离，这严重限制了通量。第二，它的chemistry有
很大的缺陷，造成raw error 1/3.
ion做到了每半年升四倍。不过以后它基本上就downsize bead这一招，downsize 一半
，通量就升四倍。
Nanopore可以改进的地方太多了，我还没法算出其通量的上限。原则上，DNA上样浓度
可以远远大于其他办法，不受单克隆限制。
技术上，Nanopore没理由不会四年后远超Ion |
|
i*********0
发帖数: 915 | 45 用了cmv和cag promotor的载体,GFP empty vector 表达还可以,不过GFP-fusion gene
就不行了,挑单克隆以后看不到荧光信号了,做WB检测fusion protein量也很低.
有没有更强一点的promotor? |
|
d***s
发帖数: 1062 | 46 一个蛋白，找不到有公司卖流式抗体的，但是有卖elisa的单克隆抗体。不知道抗体的
什么特性来决定其用途的。谢谢。 |
|
w********r
发帖数: 1431 | 47 听你的意思是要收mix population,而不是single colony
我的经验是，这种混起来的stable cell通常表达很差，
最好挑好多单个的克隆，然后选几个表达高的，然后每次实验的时候两三个Stable
line 一起用。
我们的策略是在24孔板里做transfection,然后分到6cm开始加药杀，再把细胞分到若干
10cm的盘子里继续杀，关键是密度不能高，要保证最后可以挑到单克隆。调出来的单克
隆放到24孔板里慢慢养，同时做WB检测表达。表达好的就留下，表达不好的就扔掉。
1 |
|
h******y
发帖数: 1374 | 48 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: philchenko (philchenko), 信区: Military
标 题: 广东省拟引进第三批国际科研领军人才
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jun 8 15:04:12 2012, 美东)
按照《广东省引进创新科研团队评审暂行办法》、《广东省引进领军人才评审暂行办法
》的相关规定，经公开申报、合规性审查、征求省直部门意见、第一轮同行专业评审、
第二轮现场答辩评审、实地考察、报批等程序，第三批拟引进的创新科研团队和领军人
才有关情况公示如下：
一、拟入选的创新科研团队
1固态存储系统及核心控制芯片海外创新团队
带头人邹粤林，固态存储系统技术专家，美国华美半导体学会理事，拥有超过18年
闪存芯片等IC研发经验。团队核心成员均为国际顶尖的存储系统技术专家，包括2名国
外知名高校终身教授。团队致力于固态硬盘及其核心控制芯片关键技术研发及产业化，
曾与业界著名公司共同开展多项芯片研究，创下多项业界第一，其中主持开发的闪存芯
片10年前已售出上亿件。团队在固态硬盘及控制器开发方面拥有自主知识产权核心授权
发明专利... 阅读全帖 |
|
a*******a
发帖数: 4233 | 49 首先200k的大蛋白直接transient expression都不一定能表达
其次200kd蛋白就是6kbp， 加上select marker估计要7k
我以前在es做过这个大小的，只有千分之几的marker possitive，还不知道这些colony
里哪些表达了蛋白。
es细胞可以挑单克隆让他慢慢长，其他细胞估计很难。。
仅供参考 |
|
P****o
发帖数: 172 | 50 一抗如果是单克隆抗体，二抗可考虑用 抗 subtype的。
二抗也可以用gamma chain specific的，如果用igm做对照的话。
目的细胞是老鼠来源的吗？ |
|
